分子生物学技术在食品生物安全方面的应用

1、基因检测技术在 在食品生物安全领域的应用祝 长 青江苏出入境检验检疫局食品质量安全理化安全生物安全应用于食品安全领域的主要方面转基因产品检测 过敏原检测 物种鉴别 转基因产品检测二十世纪80年代初，美国最早对转基因生物进行研究。首例转基因生物（GMO）于1983年问世，转基因作物(1986）批准进行田间试验，延熟保鲜番茄（1993）在美国批准上市，开创了转基因植物商业应用的先例.到2010年，全世界的转基因食物的种植面积预计将增至6000万公顷，市场总收入将达到3万亿美元。我国的转基因植物现状番茄（华番1号）甜椒（抗病毒）矮牵牛（改变花色）木瓜（抗病毒）大米（抗虫、抗病毒，尚未批准）大斑蝶事件

2、Losey等（Losey et al., 1999）的实验结果在Nature上发表后引起了很大的轰动。他们在实验室中用加有Bt玉米花粉的马利筋叶片来喂饲大斑蝶幼虫，加普通玉米花粉及不加玉米花粉的马利筋叶片作为对照，结果说明喂饲加有Bt玉米花粉的马利筋的幼虫第二天死亡10%以上，4天后死亡44%，而对照全部存活。此外，对加有Bt玉米花粉的马利筋摄取量小，幼虫生长缓慢，重量只有喂饲无花粉叶片的幼虫的一半。从另外一角度也可能威胁大斑蝶的生存，在无转基因抗除草剂作物前，除草剂一般只能在作物种子萌发前喷洒一次。在种植抗除草剂作物后，就可在作物生长期多次喷洒除草剂，杀死杂草而对作物无威胁，随着多次除草剂的

3、喷洒，马利筋就大量减少。由于大斑蝶的惟一的食物是马利筋，随着马利筋大量减少，也就威胁到大斑蝶的物种的生存。 Pusztai土豆事件 英国研究所有位博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。此事首次引起国际轰动。绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织组织了了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生的毕业论文都无法答辩。 英国皇家学会对此非常重视，组织了同行评审，并于年月发表评论，指出的试验有六方面的错误，即：不能确定转基因和非转

4、基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，很少统计学意义；试验设计差，未作双盲测定；统计方法不当；试验结果无一致性等。 但此事已经使GMO食品的安全性成为了全球民众与各国政府的关注焦点。StarLink玉米事件 StarLink玉米，它是由Aventis于1996年培育出来的一种可能引起过敏的转基因农作物，StarLink玉米与哮喘发作和其它一些过敏反应有关。这种玉米含有一种来自常见土壤细菌-苏云金芽孢杆菌的cry9C蛋白，cry9C蛋白能够保护玉米免遭玉米钻虫和黑毛虫的侵害。 StarLink玉米于

5、1998年被美国环境保护协会批准用只能用于动物喂养和非食物性产品上，但到了2000年，在墨西哥的玉米食品等中发现有cry9C的DNA片段。随后欧盟、日本等国也发现了StarLink玉米污染食品的情况。转基因水稻 1. 欧盟要求美国政府保证出口到欧盟地区的所有长粒水稻中不含有未经许可的转基因水稻品系LL 601，该水稻品系是由拜耳公司研发的。欧盟表示，至少在今后6个月将要求进行转基因水稻的检测，而且可能会要求进行附加检测。日本和韩国也对此表示关注，一些媒体暗示政府可能会发出禁令。 2. 2006年2008年，欧盟、日本等国在中国出口的大米或米制品中检测到有抗虫转基因大米的污染，这些品系在中国都没

6、有得到允许商业化种植的许可。因此对中国出口的米及米制品加大抽查检测力度。转基因产品检测 检测技术 基因方法：Real-time PCR ，PCR DNA Microarray 蛋白检测方法：ELISA, Quicktest strip 标准方法 5个ISO 国际标准 8 项国家标准 12项出入境行业标准 4项农业部行业标准 Quicktest strip for Cry1Ab/Accontrol testpositivenegativePrimer annealing at 50-70CMelting of DNA at 95CPolymerisation at 72C1. Cycle2. C

7、yclePCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin ElmerPCR is an exponential process定性常规PCR 样品制备 样品核酸提取 PCR体系配置 PCR扩增 凝胶电泳检测只能进行定性结果的判断（是/否），具有一定主观性。 实时荧光（Real time） PCR的原理 CT值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。图 1.Rn与时间曲线 荧光

8、实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便，无需进行凝胶电泳Real time vs 终点法荧光实时PCR的标记方法内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)实时 PCR - TaqMan Technology国内外常用的Real-time PCR 仪器Roche Light

9、Cycler 2.0Roche LightCycler 480Applied Biosystems 7500型PCR仪 Biorad iCyclerScreening targetsGene specific targetsConstruct specificEvent specific targetsLevels of specificity GMO sequencesLOWHIGHRecent Bt10 case demonstrates need for construct and event specific methods GMO荧光PCR检测项目筛选检测 Target genes:

10、 CaMV 35S Promotor, Nos teminator , NptII等 品系特异性检测 GTS40-3-2 (RoundUp Ready Soybean), BT 63, Bt176, Mon 863等 内标基因： GOS，Lectin，PLD，Zein等本实验室的GMO检测工作 国家认监委首批认可的GMO检测重点实验室； 与转基因检测领先的Eurofins/GeneScan合作成立 了基因检测联合实验室 FoodScan； 利用LightCycler 1.2 多次参加英国CSL、APLAC 的转基因检测全球水平测试，结果满意。 与农业部、中检院等合作，利用 LightCycle

11、r 480完成了转基因大米的国标协同验证，结果满意。 每年转基因检测的接近8001000批次，项目多达5000余项。TT51外源基因的LC480检测图Error: 0.134Efficiency: 1.857Slope: -3.720Y Intercept: 41.62Error: 0.0570Efficiency: 1.958Slope: -3.426Y Intercept: 38.60PLD内标基因的LC480检测图 食品过敏原的检测最常见的食品过敏源Major serious allergens include 主要严重的过敏源包括 (IFST-1999):“Big eight八大样”:

12、 eggs, cows milk, peanut, soybean, wheat, tree nuts, fish and crustacean蛋品、牛奶、花生、黄豆、小麦、树木坚果、鱼类和甲壳类食品。“Second eight八小样”: sesame seeds, sunflower seeds, cottonseed, poppy seed, fruits, beans other than green beans, peas and lentils.芝麻籽、葵花子、棉籽、罂粟籽、水果、豆类（不包括绿豆）、豌豆和小扁豆Others其它: tartrazine, sulphites and

13、latex.KFI food allergen category list* KFI食品过敏源类别清单Celery 芹菜Eggs蛋类Cows milk牛奶Peanut 花生Soybean 大豆Sulphites 亚硫酸盐Wheat 小麦Seeds 种子Seafood海鲜 Tree nuts树木坚果Cottonseed棉籽poppy seeds罂粟子sesame seeds芝麻籽sunflower seeds葵花子Crustacean甲壳类Fish鱼类almond 杏仁brazil nut巴西木坚果cashew 贾如树坚果chestnut 栗子hazelnut 榛子macadamia nut p

14、ine nuts 松子pistachio 阿月浑子的果实pecan美洲山核桃 walnut核桃*Some exemptions are included in the list - Example一些例外在-实例表中列出1.ELISA方法检测过敏原 （澳大利亚ELISASYSTEMS)：1.原理： 第一步：加入样品 第二步：加入酶标记物 第三步:加入发色剂及反应停止液加入样品后，如果样品中有过敏原（Allergy)，样品中的过敏原(Allergy)将会与包被在微孔中的特异性抗体结合。孵育15分钟后，洗去没有结合的杂质。加入酶标记物后，酶标记物会与过敏原残留物结合形成“三明治”夹心体，孵育15分

15、钟后，洗去没有结合的没标记物。如果样品中有过敏原，加入发色剂（TMB底物溶液）孵育10分钟后与酶标记物结合显蓝色，加入反应停止液停止反应，溶液显黄色，酶标仪读数或用肉眼判读颜色。1.ELISA方法检测过敏原（澳大利亚ELISASYSTEMS)：2.检测步骤：第一步：加入100ul的样品及标准品到相应的微孔中，轻微混合10秒，孵育15分钟。第二步：倒掉微孔中的液体。第三步：用洗板缓冲液洗板，重复5次。第四步：在吸水纸上拍打，直到微孔中没有残留液体。第五步：100ul酶标记物（绿盖）到每个微孔中， ，轻微混合10秒，孵育15分钟。第六、七、八步：（同第二、三、四步）1.ELISA方法检测过敏原（澳

16、大利亚ELISASYSTEMS)：第九步：加入100ul发色剂（TMB底物），轻微混合10秒，孵育15分钟。第十步：加入100ul的反应停止液，轻微混合10秒。第十一步：肉眼比色（定性检测）或酶标仪读数（定量检测）1.ELISA方法检测过敏原（澳大利亚ELISASYSTEMS)：食品过敏原检测（棉拭子法）-用于设备表面残留的检测第一步：选择一个棉拭子。第二步：在棉拭子管上标记样品号。第三步：放置棉拭子管在棉拭子管架上。第四步：打开棉拭子浸湿溶液管。第五步：将棉拭子插入浸湿溶液管浸湿棉拭子。第六步：转移面拭子，如果棉拭子太湿，在棉拭子浸湿溶液管壁上轻微压一下。1.ELISA方法检测过敏原（澳大利

17、亚ELISASYSTEMS)：第七步：用浸湿的棉拭子交叉的平行线画出阴影，或用自己的方式涂布要检测的区域。第八步：放置棉拭子到对应样品的棉拭子管。第九步：封闭好棉拭子管。第十步：储存棉拭子管，直到提取、分析。ELISA方法检测过敏原（澳大利亚ELISASYSTEMS)：过敏原（ALLERGY）检测产品表（ELISA）法）2. 荧光PCR方法检测食品过敏原检测原理： PCRFast是一种即用型的分子生物学方法，用于检测食品、设备残留样品中的特异性DNA片段。检测系统符合国际PCR标准（ISO）。该试剂盒利用实时荧光定量（Real-time PCR)的方法（含有FAM报告基因和非荧光淬灭基因的探针

18、）检测食品及设备残留中过敏原的特异性DNA片段。2.PCR方法检测过敏原(德国IFP）6.样品提取（DNA提取）： 每次PCR的分析，建议对每个样本进行两次提取，并且每个运行分析都设置提取对照(ISO 21571, 用于检测转基因生物体的食品分析方法和用于衍生产品的核酸提取方法)。 对于不同的样本，用以下优化的CTAB方法可以得到好的结果。根据不同的样本也可以采取不同的提取方法。 对于食品样本，例如蔬菜和动物脂肪或者卵磷脂，应该采用正己烷萃取法提取。 a. 经典的核酸提取方法（如CTAB方法） b. 试剂盒法提取样品核酸 （用硅胶柱纯化DNA，例如：PCRFast DNA纯化。） 一次PCR设

19、置的每个分析系统都要进行提取对照ETC分析，只加入试剂不加样本。2.PCR方法检测过敏原(德国IFP）6.3 DNA浓度的评估 总DNA的总量大于100ng不能进行PCR反应（用260nm的紫外进行检测，或者通过琼脂糖凝胶进行估算因此，如果是含有高浓度DNA的样本（大豆粉、玉米粉、香肠等样本），DNA提取物必须用0.1 x TE 缓冲液进行稀释。 DNA提取物带有抑制效应（含有可可、巧克力的食品等）同样需要用0.1 x TE 缓冲液进行稀释。例如：用步骤6.1(12)中100l的柱子或者步骤6.2中100l的洗脱柱子，已证明最佳稀释比例如下：香肠样本 1：401：80 玉米粉 1：20大豆粉

20、1：20 鳀鱼片 纯淀粉 纯 巧克力 1：10和1：20动物饲料 1：101：207. PCR设置 7.1 准备 从锡箔袋中取出所需数量的反应管，将其余的反应管和干燥剂放回锡箔袋子，密封好，贮存于2 - 8 C。准备所需量的MasterMix（每个反应管12.5 l）。2.PCR方法检测过敏原(德国IFP）7. PCR设置按下列表格所示吸取相应的量加入反应管：应当包括核酸提取对照、PCR阴性对照和阳性对照、试剂空白对照。reaction vialMaster- Mixextract sampleextract extraction controlwater deionizedfor each sample extractionsamplecolourless12.5 l12.5 l-per each analysis runpositive control PTCred12.5 l-12.5 lnegative control NTCcolourless12.5 l-12.5 lextraction control ETCcolourless12.5 l-12.5 l-2.PCR方法检测过敏原(德国IFP）8. 评估：8.1实时评估样本：下表显示了评估。阳性反应应该给出一个最后的荧光值，这个值明显高于阈值。SampleInternal amplification control