疟原虫血片制作及计数

1、疟原虫血片制作质量控制及疟原虫计数云南省寄生虫病防治所赵晓涛赵晓涛疟疾防制科科长云南省消除疟疾暨全球基金疟疾项目副主管 电子邮箱：zxt_ zxt423办公室：08792141182手机Q：35566625血片制作血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。发热病人血片标本片 血膜的制作（取血时间）取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后

2、数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；3648小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 血膜的制作（取血操作）取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒采血针（一人一针，避免血传疾病）迅速刺入耳垂下端12毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。 取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持载

3、玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成2530度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长）。将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片适当宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。（涂片操作） 厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。

4、血涂片质量评价： 均匀、厚薄、头体尾、两侧注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚 血滴小，速度慢、角度小-血膜薄血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置 通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人，涂 涂2个厚血膜1个薄血膜，以 防血膜脱落而影响检查； 疟疾调查时，每张玻片 可涂制23人血膜。标本片发热病人血片标签标签血膜的制作血膜编号 血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于

5、薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。 制作血膜的注意事项 1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。制作血膜的注意事项 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后

6、才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。制作血膜的注意事项 3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能2448小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。镜检疟原虫血片的染色一、染液的种类及染色原理染液种类： 对镜检疟原虫染色虽然种类名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的多色性染液变化过来的。 多色性染液可分为水溶液和醇溶液两类。水溶液类有罗氏（Romanowsky）染液、费氏(

7、Field)染液等；醇溶液有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。 镜检疟原虫血片的染色（一）染液的种类醇溶液类: 有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。是在水溶液染液的基础上改进发展而成。目前我们推荐的是运用醇溶液类中的吉氏（Giemsa）染液镜检疟原虫血片的染色（二）染色的原理 染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。 各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸组成。不同的氨基酸均含有氨基（NH2）和羧基（COOH）。在游离状态时，氨基（NH2）获得一个氢离子成为带阳电的离子（NH3 + ）；而羧基失掉一个氢离子成为带阴电的离子（

8、COO ）。镜检疟原虫血片的染色（二）染色的原理主要染料都含有美蓝、伊红和美蓝氧化后的天青。美蓝的有色基团带阳离子，是一种碱性染料，用的是盐酸美蓝。溶于水后离解为带阴电的氯离子和能着色的美蓝阳离子，故可于蛋白质中的羧基阴离子（COO）相结合。伊红的有色基团带阴离子，是一种酸性染料，染色用的是伊红钠盐。溶于水中时离解为带阳电的钠离子和带阴电的伊红离子故可于蛋白质中的氨基阳离子（NH3+）相结合。天青为美蓝氧化而成。虽为碱性染剂，在染色中起染媒作用。在天青与伊红的合并染色中疟原虫的核染成红色。镜检疟原虫血片的染色（二）染色的原理染色化学反应反应的示意图：疟原虫细胞浆的阴离子（COO） 美蓝阳离子呈

9、蓝色 天青（染媒作用）疟原虫核的阳离子（NH3+） 呈红色 伊红阴离子镜检疟原虫血片的染色（二）染色的原理 蛋白质本身是阴阳电荷是相等，带有两基性的。所以其所带阴阳电荷的数量可受周围液体的酸碱度（PH）而改变，在偏酸的溶液中带阳离子增加，易于伊红结合，着色偏红。在偏碱的溶液中带阴离子增加，易于美蓝结合，着色偏蓝。这就说明了为何配制染液的酸碱度直接影响了血片染色的质量，偏酸着色过红，偏碱着色过蓝。所以在染血片时稀释液要控制在PH7.2，最为适宜，疟原虫的结构才能清晰可见。 这是目前最常用的疟原虫染色剂，它具有方便、染色效果稳定的优点，也是我们推荐的染色方法。 将吉氏粉5g置于研钵中，加入少量甘油

10、充分研磨，然后边加边磨，至甘油250ml加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇250ml洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。 也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3 5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧瓶塞，置于室温内，每天用力摇动5分钟，3天后即可使用。镜检疟原虫血片的染色（三）染液的配制和染色方法1、吉氏染液的配制：吉氏染液染色方法： 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色

11、。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。 成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟，然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。 单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用2吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片标本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水1毫升，加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色1015分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。2、瑞式染液的配制： 将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml

12、甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。 此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液效果稳定，又不能大量血片染色，常用于门诊应急血片染色。 瑞氏染液的染色方法： 先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液58滴，染色12分钟。然后再加58滴蒸馏水于薄血膜上，用吸管将染液与蒸馏水混合均匀后，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10分钟。用清水轻轻冲去染液，晾干。影响染色效果的因素血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因

13、素的影响：（1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。影响染色效果的因素（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。影响染色效果的因素（3）染液稀释后使用时间 染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。影响染色效果

14、的因素（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不明显或消失。影响染色效果的因素（5）染色时间 染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。影响染色效果的因素（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏

15、碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。影响染色效果的因素(7)染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。（三） 厚薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜 用血量约为2l，涂制成2cm宽4cm长面积的薄血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，便于疟原虫虫种的鉴定。唯由于用血量少，为保证检测的敏感性，常耗时较多，不适用于大规模调查。特别在医院的化验室，由于要求在短时间内作出诊断，因而极有可能出现漏诊。 厚血膜 用血量约为4l5l。涂制成直径1cm的厚血膜由于在制备过程中红细

16、胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。受影响较大的有大滋养体、裂殖体的形态。 由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的1525倍。所以，我们推荐疟疾诊断应以检查厚血膜为主。在普查时均应查完整个厚血膜，未查见疟原虫则判为阴性。疟原虫密度计数方法一、粗略的（半定量）计数： 用厚血膜每个视野中所观察到的疟原虫的平均数可粗略地估计为疟原虫密度。 这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受制作的血膜厚度所影响，在流行病学上不宜用这种数据作疟原虫感染密度的定量分析。国内常用此方法将密度分为六级： 1 . 全厚血膜查见

17、疟原虫数在10个以内，记录实际数字； 2 . 全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”； 3 . 100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野15个，记录“+”； 4 . 100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野610个，记录“+”； 5. 100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野11100个，记录“+ ”； 6. 100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野100个以上，记录“+ ”。 2 厚血膜的疟原虫计数 根据预先测定的白细胞数目计算出每微升血液中疟原虫的数目。在制作厚血膜的同时，使用Coulter计数器或血球计确定每微升血液中的白细胞数。然后镜检厚血膜，计数同一视

18、野中的疟原虫数和白细胞数，直到所计数的白细胞数达到确定的数值为止(如果疟原虫密度较高，计数100200个白细胞即可，但在疟原虫密度很低时，计数白细胞数需达1000个)。用下式算出疟原虫密度： 疟原虫数/白细胞数白细胞数/l血=疟原虫数/l血。 如果无法进行白细胞计数，则可按常规估计白细胞数。国外最常采用的数值是8000白细胞/l血,国内常用6000白细胞/l血。 3 薄血膜的疟原虫计数 根据红细胞数目计算出每微升血液中疟原虫的数目，或根据红细胞的疟原虫寄生率计算出疟原虫密度。在涂制薄血膜的同时，使用Coulter计数器或血球计确定每微升血液中的红细胞数，如没有计数，可按常规估计红细胞数，一般男性按500万个红细胞/l血，女性按450万个红细胞/l血计算。先用油镜检查薄血膜，算出红细胞的疟原虫感染率。按下式算出疟原虫密度:红细胞疟原虫感染率红细胞数/l血疟原虫数/l血 如果疟原虫密度较高，检查1000个红细胞即可，但疟原虫密度低时，则应检查更多的红细胞。可按下列公式确定需检查的红细胞数：N=45.5(I-P)/P,N为需要检查的红细胞数，P为1万个红细胞中的疟原虫数，I为血样单位(以1万个红细胞计算），45.5为常数