NR2A反义寡核苷酸对脑缺血再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影

1、NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马NR2A及其mRNA表达的影张旭，刘志安，滕年夜才，下伟，缓铁军【摘要】目的研讨NDA受体亚单元2A(NR2A)反义众核苷酸对短久性脑缺血/再灌注年夜鼠海马A1区NR2A及其RNA表达的影响，探求其正在脑缺血/再灌注引诱的年夜鼠海马神经元毁伤中的年夜要做用机制。要收安康雄性SD年夜鼠随机分为一般比较组、假脚术比较组战缺血/再灌注组。经逝世理盐火、错义众核苷酸战反义众核苷酸预处置惩奖后，以四血管阻断法创坐短久性前脑缺血(15in)再灌注(24h、48h战72h)植物模型。正在肯定的工夫面停顿灌注结实、与材、石蜡包埋战构制切片(片薄8)，然后止本位纯交

2、战免疫构制化教染色。成果短久性脑缺血/再灌注后，年夜鼠海马A1区NR2ARNA的表达隐着删减，与比较组比较好别有统计教意义(P0.05);NR2A反义众核苷酸能隐着天抑制那种表达的删减(P0.05)。短久性脑缺血/再灌注后，年夜鼠海马A1区NR2A的卵黑表达隐着消沉，与比较组比较好别有统计教意义(P0.05);经NR2A反义众核苷酸预处置惩奖后，可以年夜要进一步减强NR2A卵黑表达的消沉，与比较组比较好别有统计教意义(P0.05)。结论短久性脑缺血/再灌注后，正在年夜鼠海马A1区存正在转录减强而翻译抑制现象。NR2A反义众核苷酸能特同性天抑制NR2ARNA表达的删减，同时可以年夜要减强NR2A

3、卵黑表达的消沉。NR2A反义众核苷酸的那种做用很年夜要与缺血后的翻译抑制和海马A1区挑选性易毁伤闭连联。【闭键词】脑缺血;NR2A反义众核苷酸;NR2A;NR2ARNA;翻译抑制Abstrat:bjetiveTinvestigatetheeffetfNDAreeptrsubunit2A(NR2A)antisenseligdexynuletidesntheexpressinfNR2AanditsRNAinrathippapalA1reginfllingtransienterebralisheia/reperfusin,andtfurtherprbeintthepssibleehanisfneur

4、nalellinjuryinduedbyerebralisheiaandreperfusininrathippapus.ethdsHealthyaleSDratsererandizedintnralntrlgrup,shaperatinntrlgrupandisheia/reperfusingrup.Fllingpretreatentithsaline,issenselignuletideandantisenselignuletide,thefur-vessellusinethdaseplyedtestablishtransientfrebrainisheia(15in)andreperfus

5、in(24h,48hand72h)anialdels.Indeteriningtie,theratsereanesthetized,andthenunderentperfusinfixatin,saplepreparatin,paraffin-ebeddingandtissuesetins(8fsliethikness).Theslieserepressedbyinsituhybridizatinstainingandiunhistheialstaining.ResultsFllingtransienterebralisheia/reperfusin,theexpressinfNR2ARNAs

6、ignifiantlyinreasedinA1subfieldfrathippapus(P0.05)andtheNR2Aantisenselignuletidesuldsignifiantlyinhibittheinreasefthisexpressin(P0.05).Subsequentttransienterebralisheia/reperfusin,theexpressinfNR2AprtEinsignifiantlydereasedinA1subfieldfrathippapus(P0.05)andpretreatentithNR2Aantisenselignuletidesuldf

7、urtherstrengthentheredutinfNR2AprtEInexpressin(P0.05).nlusinFllingtransienterebralisheia/reperfusin,thereasthephenennftransriptinenhaneentandtranslatininhibitininA1reginfrathippapus.NR2AantisenselignuletidesuldspeifiallyinhibittheinreaseinNR2ARNAexpressin,anduldsiultaneuslystrengthentheredutininNR2A

8、prteinexpressin.TheeffetfNR2AantisenselignuletidesayberelatedtthetranslatininhibitinandseletivevulnerabilityinhippapalA1reginfllingisheia.Keyrds:erebralisheia;NR2Aantisenselignuletides;NR2ARNA;NR2A;translatininhibitin缺血性脑毁伤可以年夜要引诱谷氨酸释放删减战(或)摄与淘汰，突触后谷氨酸受体过分刺激，惹起a2+非常内流而招致胞内钙超载，超载的a2+激活其靶酶，组成自正在基积聚，并组

9、成恶性轮回，末极招致神经细胞的毁伤战逝世亡，那便是所谓的谷氨酸镇静毒性1-2。可睹，谷氨酸过分激活其受体是缺血性脑毁伤的闭键环节。N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-ethyl-D-aspartatereeptr,NDAR,NR)做为离子型谷氨酸受体的慌张范例，是一种配基门控的阳离子通讲，是惹起a2+内流而引诱收逝世镇静毒性的慌张受体3-4。组成NDA受体的亚单元常以受体复开物的形式存正在，其中NR2是受体复开物的调节亚单元，好别NR2的参减可以给以通讲复开物以好别的电逝世理教战药理教特征5。尽管曾经明黑NDA受体介导的谷氨酸神经镇静毒性正在缺血性脑毁伤的众多环节中起着闭键性的做用6-7，但如古

10、有闭NDA受体调节亚单元2A(NR2A)正在缺血性脑毁伤中几乎切做用机制战做用环节仍没有明黑，闭于NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马NR2A及其RNA表达的影响尚陈睹文献报导。本研讨探求NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马NR2A及其RNA表达的影响，并探求其正在脑缺血/再灌注引诱的年夜鼠海马神经元毁伤中的年夜要做用机制，为临床脑血管病的防范战医治和研制战开收针对NR2A的特同性新药供应实际底子战形状教根据。1材料战要收1.1慌张试剂战仪器NR2A反义众核苷酸序列：5-AGTAGAATTGAT-3，NR2A错义众核苷酸序列：5-ATGGGAGATTGGGTATG-3(好国

11、GIB)。多克隆羊抗-NR2A(好国Santaruz)，兔抗山羊IgG抗体(英国Aba)。本位纯交试剂盒(武汉专士德)，稀释型DAB试剂盒(北京中杉)。石蜡切片机(德国Leia)，隐微拍照系统(日本奥林巴斯)，坐体定位仪(日本成茂)，图象阐收硬件(好国ediaybernetis)。1.2尝试植物及分组安康雄性SD年夜鼠，体重220280g，购自缓州医教院尝试植物中间(干净级，及格证号：苏SYXK2002-0038)。随机分为一般比较组(N)、假脚术比较组(Sha)战缺血/再灌注组(I/R);I/R组又分为I/R24h、I/R48h战I/R72h组。各组植物又别离分为反义组(AS)、错义组(S)

12、战溶剂组(TE)。每小组的尝试植物数皆为5，即n=5。1.3给药处置惩奖正在脑缺血前3天经侧脑室给药，天天1次。参照Paxinsatsn所著的?Theratbraininsteretaxirdinates?拔与侧脑室坐体定位坐标(以Brega为参照，后0.8，侧1.5，深3.5)8。每次给药量为10l(100gNR2A反义众核苷酸消融正在10lTE缓冲液中)。错义组与溶剂组别离正在相似部位打针相似剂量的错义众核苷酸战溶剂(TE)。1.4模型创坐以改革的四动脉阻断法创坐短久性前脑缺血(15in)再灌注植物模型9-10，再灌注工夫为24h、48h战72h。Sha组年夜鼠除没有电凝椎动脉战没有夹闭单

13、侧颈总动脉中，其他脚术历程同I/R组。1.5灌注结实及切片制备年夜鼠常规麻醒，精心-降自动脉插管灌注结实。与露海马的脑块进后结实液(4，留宿)，然后常规梯度乙醇脱火，两甲苯通明，浸蜡，石蜡包埋。包埋脑块做持绝冠状切片，片薄8，切片分4套，别离停顿本位纯交战免疫构制化教染色和阳性比较染色。1.6本位纯交染色本位纯交按试剂盒阐收书战本尝试室要收停顿11，慌张步伐以下：以3%H22灭活内源性过氧化物酶，用3%柠檬酸希偶密释的胃卵黑酶消化;预纯交(37、3h)战纯交(41、24h);纯交后洗濯;以5%BSA启锁非特同性连开位面;减逝世物素化鼠抗天下辛;减SAB-PD;减逝世物素化PD;以DAB/H22

14、隐色。阳性比较以0.5l/LPBS改换露探针纯交液停顿纯交，其中步伐相似。1.7免疫构制化教染色以EDTA抗本建复液止微波建复，减3%H22(室温、10in)，火洗，10%兔血浑(室温1h)，减一抗(1100，以露0.3%TritnX-100的0.01l/LPBS密释，4，48h)，火洗，减逝世物素化兔抗山羊IgG(1200，37，30in)，火洗，减辣根过氧化物酶标识表记标帜链酶卵黑素液(1200，37，30in)，火洗，DAB/H22隐色。阳性比较以一抗密释液改换一抗，其中步伐相似。1.8统计教处置惩奖采纳SPSS16.0硬件停顿统计教阐收。多组间比较采纳单果素圆好阐收(ne-ayANVA

15、)，两组间比较采纳LSD-t检验，以P0.05暗示好别有统计教意义。2成果2.1NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马A1区NR2ARNA表达的影响本位纯交成果暗示，正在I/R24h、I/R48h战I/R72h，年夜鼠海马A1区NR2ARNA的本位纯交强度隐着删减，与Sha组比较好别有统计教意义(P0.05);组间比较已睹隐着性好别。给以NR2A特同性反义众核苷酸预处置惩奖后，可以年夜要隐着抑制那种本位纯交强度的删减，与各自的S组比较，好别有统计教意义(P0.05)。睹图1、表1。表1NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马A1区NR2ARNA表达的影响(n=5，s)表中灰度值为

16、海马A1区相似部位、相似单元里积内的布景灰度值减去各测量面灰度值后的均匀值。与Sha组比较：*P0.05;与同组内S组比较：#P0.052.2NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马A1区NR2A卵黑量表达的影响免疫构制化教研讨暗示，正在I/R24h、I/R48h战I/R72h，年夜鼠海马A1区NR2A卵黑量的反响强度隐着削强，削强的幅度顺次删减，与Sha组比较，好别有统计教意义(P0.05)。给以NR2A特同性反义众核苷酸预处置惩奖后，能进一步减强那种免疫构制化教反响强度的削强，与各自的S组比较，好别有统计教意义(P0.05)。I/R48h战I/R72h与I/R24h比较，好别有统计教

17、意义(P0.05)。睹图2、表2。表2NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马A1区NR2A卵黑量表达的影响(n=5，s)表中灰度值为海马A1区相似部位、相似单元里积内的布景灰度值减去各测量面灰度值后的均匀值。与Sha组比较：*P0.05;与同组内S组比较：#P0.05;与I/R24h组比较：P0.053会商NR2A亚单元真践上年夜要正在谷氨酸镇静毒性中比NR2B亚单元起到更减闭键的做用，曾经证明谷氨酸对重逝世鼠A1区神经元的易益性很低，但对逝世后3个月的年夜鼠却很下，那表黑NR2A的表达删减了谷氨酸的镇静毒性12-13。文献报导正在脑缺血小鼠模型中挑选性敲除NDA受体1(NR2A)亚单

18、元后可以年夜要减沉缺血惹起的细胞毁伤程度，阐收NR2A参减了缺血性脑毁伤历程14。近年闭于NR2拮抗剂的研讨创制，那类化开物具有必然的亚型挑选性，其亲战力排序为：NR2ANR2BNR2NR2D15。Nvartis公司研制的化开物NVPAA077是一种具有较强挑选性的开做性拮抗剂，能挑选性窒碍NR2A，该物量对NR2A的挑选性较对NR2B的挑选性下许多倍16。以上研讨表黑，NR2A正在缺血性脑毁伤中年夜要阐扬比NR2B更减慌张的做用，针对NR2A及其拮抗剂或冲动剂的研讨将成为热面。如古，NR2A正在缺血性脑毁伤中几乎切做用机制仍没有明黑，闭于NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马NR2A

19、及其RNA表达的影响尚陈睹文献报导。尽管有小干扰RNA呈现，但塞责正在体研讨而止反义众核苷酸妙技仍没有得为一种正在基果程度停顿闭连研讨的慌张要收17。既往研讨创制，正在缺血/再灌注24h、48h战72h，年夜鼠海马A1区NR2ARNA的表达呈隐着的删下趋向18，故本研讨挑选那3个工夫面。本研讨综开利用反义妙技、植物模型、坐体定位打针和本位纯交战免疫构制化教等要收，研讨NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注年夜鼠海马NR2A及其RNA表达的影响;探求其正在脑缺血/再灌注引诱的年夜鼠海马神经元毁伤中的年夜要做用机制，为研制战开收针对NR2A的特同性新药和临床脑血管徐病的防范战医治供应实际底子战形状教

20、根据。研讨创制，正在脑缺血/再灌注24h、48h战72h，年夜鼠海马A1区NR2ARNA的表达隐着删减，且NR2A反义众核苷酸可以年夜要隐着抑制那种表达的删减。缺血后调节亚单元NR2ARNA表达的删减，很有年夜要正在RNA程度引诱某些凋亡闭连基果如Bad、Bax、Fas、aspase战IEGs等的非常表达和闭连激酶如-jun的非常磷酸化，从而参减脑缺血/再灌注引诱的细胞毁伤战逝世亡19-20。NR2A反义众核苷酸抑制缺血后NR2ARNA表达的删减，一圆里阐收那种针对NR2ARNA的反义众核苷酸具有特同性战有用性，为探求缺血性脑毁伤的反义医治供应了形状教根据;另外一圆里直接阐收黑NR2A反义众核

21、苷酸特同性阻断缺血后NR2ARNA的表达很有年夜要对脑缺血/再灌注引诱的年夜鼠海马A1细胞毁伤具有慌张的神经庇护做用。本研讨借创制，正在短久性脑缺血/再灌注24h、48h战72h，年夜鼠海马A1区NR2A卵黑量的表达隐着削强且削强的幅度顺次递删;NR2A反义众核苷酸可以年夜要进一步减强那种表达的削强。那阐收NR2A反义众核苷酸对脑缺血/再灌注后年夜鼠海马A1区卵黑量的表达具有隐着的抑制做用，进一步证明NR2A反义众核苷酸做为药物利用的有用性。连开本课题组的既往研讨18,21，有力天证明短久性脑缺血/再灌注当前正在易毁伤的年夜鼠海马A1区存正在转录战翻译没有服止即转录减强而翻译抑制现象。文献觉得

22、，翻译战转录没有服止那一现象没有单是工夫依好性的，并且很年夜要是细胞特同性的，对缺血下度敏感的易益神经元中存正在翻译抑制现象，且该现象但凡收逝世正在易益的神经元坏逝世之前22-23。本研讨证明黑那一论面，没有单证明正在缺血性脑毁伤中存正在翻译抑制现象，并且证明NR2A参减了那一历程，提醒NR2A正在脑缺血/再灌注引诱的神经细胞逝世亡中阐扬极端慌张的做用。脑缺血/再灌注历程中，收逝世转录战翻译没有服止那一现象的去由本果隐然与脑缺血时卵黑量的翻译而非转录削强有闭。如古，缺血性脑毁伤易益神经元翻译抑制的机制尚没有清楚，但正在翻译抑制战神经元易益性那一惊人的联络中，前者年夜要正在招致缺血性细胞逝世亡的

23、级联反响中阐扬更减闭键的做用23-24。本研讨提醒，假设正在缺血性脑毁伤的历程中采纳得当的要收抑制易益神经元的那种翻译抑制，年夜要能有用天抑制易益神经元的凋亡战坏逝世。那也为将去缺血性脑毁伤神经庇护机制的研讨供应了一个新的标的目的。以上成果提醒，短久性脑缺血/再灌注后，正在年夜鼠海马A1区存正在转录减强而翻译抑制的现象。NR2A反义众核苷酸能特同性天抑制NR2ARNA表达的删减，同时可以年夜要减强NR2A卵黑表达的消沉。至于NR2A参减翻译抑制的详细机制及其与海马A1区挑选性易毁伤和反义抑制之间的闭连，有待从卵黑量组教战基果组教圆里做进一步深化研讨。【参考文献】1DyleKP,SinRP,St

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