血管性痴呆小鼠海马NOS活力和nNOS蛋白表达的改变

1、血管性痴呆小鼠海马NOS活力和nNOS蛋白表达的改变【关键词】血管hangesfNSativityandnNSexpressininhippapusfvasulardeentiaie【Keyrds】deentia,vasular;hippapus;neurnalnitrixidesynthase;nitrixidesynthase【摘要】目的：观察血管性痴呆(VD)小鼠海马内一氧化氮合酶NS的活性和神经元型一氧化氮合酶nNS阳性神经元的表达，讨论VD的发活力制.方法：复制小鼠VD模型，利用Y迷宫检测VD模型小鼠学习记忆才能，采用NADPHd组织化学和nNS免疫组织化学方法，研究VD小鼠与正常小

2、鼠海马NS和nNS阳性神经元数量的变化.结果：VD小鼠比正常小鼠Y迷宫学习记忆训练次数明显增多，差异有显著性P0.01；海马A1区NS和nNS阳性神经元的数量明显增多，差异有统计学意义P0.05.结论：VD的发生可能与海马NS和nNS阳性神经元的数量增多有关.【关键词】痴呆，血管性；海马；神经元型一氧化氮合酶；一氧化氮合酶0引言自20世纪80年代发现内源性一氧化氮nitrixide,N以来，其复杂的生理及病理作用已引起人们的广泛重视.N是由一氧化氮合酶(nitrixidesynthase,NS)催化L精氨酸而生成，NS在脑缺氧缺血中的双重作用已日益受到重视.我们采用组织化学和免疫组织化学的方法

3、，讨论(vasulardeentia,VD)小鼠海马构造内NS和nNS阳性神经元数目的变化以期提醒VD的发活力制.1材料和方法1.1材料成年安康昆明系雄性小鼠共36只购自天津市实验动物中心，体质量(303)g，随机等分为3组：正常对照组、假手术组、VD模型组n=12.1.2方法10L/kg,ip麻醉后，仰卧固定在手术台上，颈正中切口，手术别离双侧颈总动脉nartidarteries,A穿线备用，模型组在夹闭双侧A之前，腹腔注射硝普钠2.5g/kg，随即用无创动脉夹夹闭双侧A10in，通10in,再夹闭10in,再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养1.假手术组麻醉及手术方法与模型组一样，但仅暴露双侧

4、A，不阻断A,不注射硝普钠，观察时间与模型组一样.有光、无电适应60s后切换光源无光源的两臂及三臂连接处有电，待动物进入有光无电处后开场记时，30s时切换光源.如此进展切换20次，每次切换光源都使动物学习1次，每日每只动物最多如此学习20次，第20次切换后待动物进入有光无电处后适应30s将动物取出.每只动物连续9次从无光有电处直接进入有光无电处为学会，第1日学不会者第2日继续学习，直至学会.将学会次数进展统计学分析.10L/kg,ip麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，并剪开右心耳形成灌注液排出通道，从左心室快速灌注温生理盐水，至流出液清亮，此时接着灌入4的40g/L多聚甲醛

5、，3040in灌毕，迅速取脑置于4的40g/L多聚甲醛固定液中后固定6h，100,200和300g/L蔗糖溶液梯度脱水.将大脑沿矢状面切开，将左侧大脑半球置于恒冷箱冰冻切片机内做连续冠状冰冻切片，片厚约50,0.01l/LPBSpH7.4接片后进展NADPHd组化染色和nNS免疫组化染色.反响液，37孵育1h，反响液成分：NADPHSiga公司5g，NTB(氯化硝基四氮唑蓝，华美公司)2.5g,3L/L的TritnTBS5L.终止反响后裱片，脱水，透明，封片.反响切片移入373L/L的TritnH22中孵育30in,PBS缓冲液漂洗后以30L/L的正常羊血清封闭30in，然后加nNS抗体120

6、0,Santaruz公司，4温盒内孵育72h.漂洗后加生物素标记的兔抗羊血清1200，37孵育1h，漂洗后AB液1100,Vetr公司37孵育1h，漂洗后加0.5L/L的DAB和0.1L/L的H22显色，镜下控制反响时间510in，常规裱片，脱水，透明，封片.DG三区所有NS和nNS阳性细胞数.统计学处理：利用SPSS11.0统计软件对数据进展统计学分析，结果以xs表示，经方差齐性检验，表1方差不齐，采用多个样本的秩和检验，表2和表3方差齐，组间差异比拟采用单因素方差分析和两两比拟的q检验.2结果2.1VD小鼠行为学测试与正常对照组和假手术组相比，VD模型组小鼠Y迷宫学习记忆次数明显增加，差异

7、显著(13441)vs(4314)和4710，P0.01；而正常对照组与假手术组相比，差异无统计学意义；VD模型组小鼠学习记忆才能明显降低.2.2VD模型组小鼠海马各区NADPHd阳性神经元数量的变化与正常对照组和假手术组相比，VD模型组小鼠海马及其A1区NADPHd阳性神经元数量明显增多，差异有统计学意义P0.01，A3区和DG无明显差异；而正常对照组与假手术组相比，海马各区神经元数量均无统计学差异，说明VD模型组小鼠海马及其A1区NS阳性神经元数量明显增多表1,图1).表1VD小鼠海马及其各分区的NS阳性神经元数量略2.3VD模型组小鼠海马各区nNS阳性神经元数量的变化与正常对照组和假手术

8、组相比，VD模型组小鼠海马及其A1区nNS阳性神经元数量明显增多，差异有统计学意义P0.01，A3区和DG无明显差异；而正常对照组与假手术组相比，海马各区神经元数量均无统计学差异；VD模型组小鼠海马及其A1区nNS阳性神经元数量明显增多表2,图2).表2VD小鼠海马及其各分区nNS阳性神经元数量略3讨论目前常用于VD研究的动物模型主要有四血管阻断4V法和两血管阻断2V法.有报道说明，较严重的不完全性脑缺血动物大脑损伤较一样时间完全脑缺血的动物恢复差.因此本研究采用王蕊等1的VD模型方法制作动物模型.N性质活泼，半衰期极短，在体内生物半衰期仅数秒钟，故N的作用与NS程度亲密相关，对NS蛋白表达变

9、化的研究是对N进展深化讨论的重要环节.NS有3种类型，分别为nNS,eNS和iNS，其中nNS产生的N可致脑缺氧缺血的早期脑损伤.N作为细胞内信使参与长时程增强LTP的诱导和形成，NS与N可影响学习记忆等过程，nNS被认为是影响学习记忆的关键酶.海马是脑组织对缺氧缺血最敏感的部位之一，脑缺氧缺血时，由于能量代谢衰竭，可致离子泵功能障碍，兴奋性氨基酸释放，大量a2内流，激活a2依赖性NS，导致N的过量合成，N在缺氧缺血性脑损害中的作用已日益受到重视.任何来源的N在高浓度时均可抑制多种线粒体电荷传递系统的酶，从而抑制细胞呼吸和能量代谢；N还可以通过与氧自由基反响形成活性更高的毒性基团，通过脂质过氧

10、化作用、酶灭活及DNA硝化作用导致神经元的死亡.有实验说明N作为一种血管、神经活性物质，具有调节脑血流、促进或抑制神经递质释放、参与突出可塑性、神经元兴奋毒性及炎症损害等多种作用，且与学习和记忆有关.据报道给大鼠腹腔注射NS抑制剂，可损害大鼠学习记忆才能，而注射N的合成原料可减轻这种损伤，脑组织NS的持续性激活及一氧化氮含量的升高不仅参与缺血性脑损害，而且在痴呆形成中可能发挥重要作用2.本结果显示VD小鼠海马A1区NS及nNS阳性神经元数量明显升高，并且与行为学上变化相一致，而A3区和DG无明显变化，这可能与海马A1区是缺氧易损区、海马A3区和DG是缺氧抵抗区有关3，说明海马中的NS阳性神经元可能参与了VD的形成，为将来讨论VD的防治提供了进一步研究的根底.【参考文献】1王蕊，杨秦飞，唐一鹏，等.大鼠拟“血管性痴呆模型的改良J.中国病理生理杂志，2000,1610:914-916.2eyerR,SpanglerEL,PatelN,etal.Ipairedlearninginratsina14unitTazeby7nitrindaz