细胞生物学实验手册：整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备及观察

1、实验十八 整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备及观察【实验目的】在相差显微镜和透射电子显微镜下，观察整装培养细胞中生物膜系统的结均和分布。【实验用品】 一、材料和标本 非洲绿猴肾上皮细胞（CV-1）。 二、器材和仪器 普通显微镜、相差显微镜、透射电子显微镜、镍网、载玻片、盖玻片、直径5cm培养皿、CO2培养箱。 三、试剂 高锰酸钾固定液、10g/ml秋水仙素、PBS(Ph7.4)、0.5Formvar液。【实验内容】 一、原理 本室宋今丹教授于1984年研制出一种新的高锰酸钾固定液，用以固定整装培养细胞。该固定液能除掉细胞内的蛋白质成份，而保留膜的脂类成分，其结果，细胞骨架和细胞内可

2、溶性蛋白质等被去除，增加了标本的透明度，同时内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体等生物膜系统被完整地保存下来。高锰酸钾固定剂在固定标本的过程中，能形成二氧化锰，可在细胞的各种膜结构的脂类亲水端形成微细的沉淀，结果标本不需染色，即能在相差显微镜和透射电镜下清晰地显示细胞生物膜系统全貌。二、方法 （一）高锰酸钾固定法显示用药(秋水仙素处理)前后CV一1细胞生物膜系统光镜标本的制备及观察。 1取无菌盖玻片，分别放入二个直径5cm的培养皿中，接种CV一1细胞，加3ml培养基。加盖做好标记，移入CO2培养箱培养24小时。其中一个培养皿在终止培养前4小时，加入10gml秋水仙素0.3ml。在倒置显微镜下观察选

3、定长有铺展良好细胞的盖玻片，终止培养，倒掉培养液。 2PBS液冲洗盖玻片二次，清除细胞表面的培养基和杂质。 3取出盖玻片，将长有铺展良好细胞的盖玻片，细胞面朝上放在载片上。 4滴新配制的高锰酸钾固定剂于盖玻片上，固定10分钟。 5蒸馏水轻轻地冲洗标本的细胞面5次，去除残留固定液。 6取下盖玻片，用滤纸吸干多余水份，滴1滴PBS液于载玻片上，将盖玻片附有细胞面朝下，装片。 (二)高锰酸钾固定液显示用药(秋水仙素处理)前后CVl细胞生物膜系统电镜标本的制备及观察。 1用0.5Formvar液制做支持膜。将覆有Formvar膜的镍网经紫外线灯灭菌后，放入直径5cm的无菌培养皿中。加培养基3m1。 2

4、接种CV一1细胞于铺有支持膜的镍网上，一组是不经药物处理的作为对照组，另一组是经lOgml秋水仙素处理的作为实验组。实验组的培养细胞在终止培养前4小时加入10gm|秋水仙素0.3ml，放入CO2培养箱中进行细胞培养。 3待细胞铺展开后，取出镍网，用乳头吸管滴1滴高锰酸钾固定液于镍网上，固定细胞10分钟。 4经上升梯度乙醇系列脱水：305070859095100，每次脱水3分钟。 5待镍网晾干后，在透射电子显微镜下(75KV电压)进行观察。 三、结果 在光镜下和透射电子显微镜下，内质网呈网状铺展于整个细胞质内。细胞核周围的内质网形成较稠密三维结构，远离细胞核周围的内质网则呈松散的网状伸展至细胞边

5、缘。在电镜下可见内质网由细管和扁囊构成。除内质网外，还可看到粗大的呈条索状的线粒体，也可观察到高尔基器和溶酶体等膜性结构。 CV一1细胞经秋水仙素处理后，其内质网向细胞核周围聚集，细胞边缘区域不再观察到内质网。秋水仙素破坏微管结构，因此，内质网的分布可能与微管的存在有密切关系。【作 业】l为什么经高锰酸钾固定液固定的整装培养细胞可以观察生物膜系统?2为什么高锰酸钾固定液固定细胞后，细胞不经染色便可在电镜下进行观察?3CV一1细胞在秋水仙素处理后其生物膜系统的分布有何变化?请谈谈你的看法。 附：镍网Formvar(聚乙烯醇缩甲醛)膜制备 1将载玻片插入0.5Formvar的氯仿溶液中，抽出。待干燥后用刀片