07药品无菌检查与隔离器的应用-戴翚

1、药品无菌检查与隔离器的应用中检院微生物检测室 戴翚中国食品药品检定研究院Nat al Institutes for Food and Drug Control无菌检查的相关概念 用于药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法定义性质 是有关药品安全的一种定性试验 根 培养基中是否有微生物生长判断结果 环境 人员、用品无菌性、检验数量、检验量、培养基适用性、方法 用性、培养条件等影响因素 微生物污染不 匀 检验方法局限局限性National Ins tutes for Food and Drug Control无菌检查法发展历史我国历版药典无菌检查法发展历史国

2、际无菌检查法发展历史1953版 实验环境仅要求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法；用一种培养基检查1925年 直接接种法首先在英国使用1932年 英国药典推荐使用 菌测试1963版 仅直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌1977版 开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培养基分别培养细菌和霉菌1936年 美国药典第十一章首 引用单个培养基的直接接种法1950年 美国药典第十 章推荐使用FTG和TSB两种培养基分别 培养需、 菌和真菌1985版 收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。1995版 开始要求对培养基进行灵敏度检查。20

3、00版 规定实验环境为100级洁净度；检验数 从2支/瓶增加为611支/瓶；1957年 美国FD 和MILLIP E公司介绍膜过滤法用于抗生素无测试1963年 英国药典63版收载薄膜过滤法无菌测试1965年 美国药典引用薄膜过滤 用于非抑菌性药品的无菌测试1971年 欧洲药典第二版公布参 薄膜过滤 菌测试1978年 欧洲药典修订版 行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试1988年 美国FDA规定：假如第一次无菌检查不符合规定的样品明确薄膜过滤法为首选方法，收载全封闭过滤技术。2005版 收载隔离系统，强调洁净度验证；培养基适用性检查包括无菌性检查和灵敏度检查；开始明确规定检验方法的验证试验要求；不再

4、复试，这一批次的药品应报废。无菌阳性后再测试的机会排除了药品1998年 英国药典1998无菌测试以一次 出为准，取消复试。2000年 美国药典24版无菌测试以一次检出为准，取消复试。应优先采用薄膜过滤法，延长培养时间为至少14天、取消复试。National Ins tutes for Food and Drug ControlUSP35部分章节中国药典2015年版Antimicrobial Effectiveness Testing抑菌效力检查法Biological Indicators-Resistance Performance Tests生物指示剂抗性检查法Microbiological

5、 Examination of Nonst ile Products: MicrobialEnumeration Tests非无菌产品微生物检查：微生物计数法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法MicroorganismsMicrobgical Attributes f Nonsterile Pharmaceu cal Product非无菌药品微生物限度标准支原体检查法Mycoplasma TestsSterility Te无菌检查法Biological

6、 dicators fterilization灭菌用生物指示剂指导原则水活度检查法用于非无菌药品微生物评价A cation of Water Activity Determination to NonsterilePharmaceutical ProductsMicrobial Characterizaentification, and Strain yping微生物鉴定指导原则Microbiological Eva tion of Clean Rooms and Other C ntrolledEnvironments药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则Microbiological Be

7、st Laboratory Practic药品微生物实验室质量管理指导原则无菌检查用隔离器 统验证指导原则灭菌法Sterility Testing-Validation of Isolator Sys msSterilization and Sterility Assuran of Compendial ArticlesValidation of Alternative Microbiological Methods药品微生物检验替代方法验证指导原则/非无菌药品微生物限度检测指导原则/（日本药典收载）中药饮片微生物限度检查法？药品无菌检查的过程控制无菌性检查灵敏度检查环境保证培养基保证SOP操

8、作有效的方法方法适用性有效的结果可靠的结论结果判断National Ins tutes for Food and Drug Control药品无菌检查的过程控制无菌检查用隔离系统验证指导原则对照培养基培养基保证无菌性检查灵敏度检查环境保证SOP操作有效的方法方法适用性有效的结果可靠的结结果判断National Ins tutes for Food and Drug Control案例阳性结果与玻璃安瓿表面采样菌高度相似National无菌检查过程微生物控制 空气微生物浮游菌沉降菌 表面微生物样品包装表面操作人员手部Nntrol玻璃安瓿表面消毒方案比较 杀孢子剂（过氧乙酸）喷洒后立即（3min、

9、5min、10min）用75%乙醇钝化，再用湿棉签擦拭取样 酒精灯过火1秒钟（3秒钟、5秒钟、10秒钟）后直接用湿棉签擦拭取样表面消毒方案 作用时间 残留菌落数 菌属类型杀孢子剂立即3minmin2cfu0cfu0cfu0cfu4cfu10cfu0cfu0cfuBacillus/10min1秒钟3秒钟5秒/棉签擦拭&过火Bacillus、BrevibacillusBacillus、Paenibacillus、Brevibacillus/10秒钟/National Ins tutes for Food and Drug Control主要验证环节环境验证的实质区域设备证明任何程序、生产（实验）过

10、程、设备、物料、活动或系统确实能达到预期结果的有文件证明的一系列活动。培养基方法无菌性灵敏度制备过程检查过程验证的目的规范要求过程受控、满足预期、形成文件提供相应的质量保证生产（实验）过程的稳定性、可靠性得到符合预期品质属性的产品（实验结果）National Ins tutes for Food and Drug Control无菌检查环境要求无菌检查：环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中B+验证、转移、确认TRANSFER OF ANALYTICAL PROCEDURESVALIDATION OF COMPENDIAL PROCEDURESVERIFICATIO

11、N OF COMPENDIAL PROCEDURES 、人员（具象） 过程、方法（抽象）icationValidatioLudwig Huber Va idation and Qualification inAnalytical Lab ratoriesNew York, USA, 2007Transferrificatio 确认的文件化过程 确认适用性tional Ins tutes for Food and Drug Control环境验证National Ins tutes for Food and Drug Control隔离器应用于无菌测试隔离系统通过基本结构实现无菌操作良性工作流程

12、ational Inut s for Food and Drug Control隔离器的全舱灭菌 每次隔离器启用前进行全舱灭菌 汽化过氧化氢经HEPA进入舱体 不涉及物 装载 保证操作舱与传递舱贯通传递舱的灭菌 全舱灭菌后关闭操作舱门，操作舱实现无菌保持 严格遵照验证过的装载模式对供试样品/器具的表面进行消毒National Ins tutes for Food and Drug Control隔离系统用于无菌测试隔离器URS 性能1.检测处理 材质与结构1.基本结构2.无菌保证要求3.清洁&清洁确认4.密封性能2.关键部件材质3.送风系统及空气过滤4. 口5.环境控制6.泄露测试5.控制单元

13、6.附加设备7.监控系统8.环境微生物监测9.过程模拟试验National Ins tutes for Food and Drug Control隔离器安装环境中国药典2015版9206无菌检查用隔离 安装环境的洁净度要求应不低于我国现行GMP中D级空气洁净度要求，安装隔离器的房间应限制无关人员出入。National Ins tutes for Food and Drug Control隔离系统实验室基本设施参数od and Drug Control隔离系统验证ood and Drug Control隔离系统验证National Ins tutes for Food and Drug Cont

14、rol安装确认IQ 主要验证项目 文件资料文件资料 结构与构造材料 安装环境管道仪表流程图衔接部件电气组件 测量仪表线路检查传输部件 HEPA及其他除菌过滤器 易耗部件变频器参数确认传感器校准确认 操作软件操作软件界面确认输入/输出确认泄露测试高效完整性IQ-构造、线路传感器确认变频器参数确认泄露测试高效完整性操作确认（OQ） 控制有效性 参数设定 报警功能 操 软件 尘埃微粒每小时换气率压力控制测试运行测试 系统完整性压力下降试验泄露测试发烟测试粒子测试HEPA粒子扫描操作等级确认 灭菌设备功能与过程参数 灭菌循环程序（步骤、运行值与设定值的相符性）National Ins tutes fo

15、r Food and Drug Control每小时换气率压力控制测试功能运行测试发烟测试粒子测试-自净灭菌循环开发（CD） 隔离器内物料装载模式与要求 开发与验证最坏装载模式下的循环标准装载模式确认生物指示剂确认优化装载循环灭菌循环验证排空测试rug Control标准装载模式确认多种装载模式测试生物指示剂确认 汽化过氧化氢灭菌过程采用的生物指示剂嗜热脂肪地芽孢杆菌（ Geobacillus stearothermophilus ）ATCC12980 or ATCC7953生物指示剂确认优化装载循环灭菌循环验证 根据隔离器体积大小，每立方米放置5-10个BI是足够的，均匀分布于内表面，以证实

16、杀菌剂的分布均匀性。-PDA TR34灭菌循环验证 确认过的装载模式 增加生物指示剂挑战 平行3次灭菌循环验证 不锈钢桶更利于汽化过氧化氢扩散 全舱灭菌关闭DPTE门排空测试包装完整性包装完整性 单层塑袋密封 全程1ppm 单层呼吸袋密封Stabilization 2ppmAeration 20ppm 双层包装 0.0ppmr清洁验证 无菌试验用隔离器的清洁验证并非关键，清洁至无目视污染的程度即可。 有抗菌活性的粉剂应予重视，防止其扩散而影响其他产品或批次中低污染微生物的检出 清洁方案，频率，材料等应进行文件规定并形成记录。National Ins tutes for Food and Dru

17、g Control无菌维持与环境监测 建立隔离器内部环境的监测系统和程序 环境物理监测：尘埃微粒、压差等 环境微生物监测1. 动空气取样（浮游菌）2.被动空气取样（沉降菌）3.表面取样（swab、RODAC）4.手套采 （指印）Nationa无菌室C级浮游菌高限图硬件差异软件差异National Ins tutes for Food and Drug Control无菌程序保障 无菌检查样品前处理分批消毒、实验（混合） 统一消毒，统一实验 严格遵守外表面消毒程序一般环境酚类 phenylphenol tertiary amylphe l ） 洁净环境过氧乙酸+7 %乙醇（无菌级）（苯式 酚/三

18、级戊基苯酚） 增加过程监控力度表面菌采样、手部采样（每批）、动态 游菌采样（下风口）National Ins tutes for Food and Drug Control无菌室C级浮游菌分布图比较National Inutes for Food and Drug Control隔离器内表面微生物监控隔离器内的表面微生物监控模式定量 定性环境微生物归属National Ins tutes for Food and Drug Control欣弗事件夺命的欣弗欣弗培养物孢杆菌粘质沙雷菌鉴定结果、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；、粘质沙雷菌 S.marcescens）、肺炎克雷伯（K.pn

19、eumoniae ）；、粘质沙雷菌（S.marcescens）、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ；、粘质沙雷菌（S.marcescens）洁净环境常见菌：、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；、阴沟肠杆菌（Enter. cloacae）头状葡萄球菌（Stap l溶血葡萄球菌（Staphylo305L；305G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）缓症链球菌（Streptococcus mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）藤黄微球菌（Micrococcus luteus山羊葡萄球菌（Staphyl

20、ococcus caprae）306L/6G 肺炎克雷伯（K neumoniae ）307G308L309L304G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）粪产碱杆菌（Al.faecalis）粪 碱杆菌（Al.faecalis）嗜麦芽寡养单胞菌（S.maltophilia）环境物理监测 尘埃粒子监测确认HEPA的有效性层流/紊流自净方式差异计数器需连通采样管 压差 温/湿度隔离系统应用于无菌测试 提供更可靠的无菌环境由于VHP具有较强的杀菌效力（尤其对芽孢的杀灭），使隔离舱内的无菌环境更有保障，无菌测试的假阳性结果几乎不可能出现。 隔离系统能支持两种无菌测试的方法，直接接种法和薄膜过滤法，具有

21、相对广泛的适用范围。 保护样品 试验器具，亦保护操作者免受有毒样品的伤害，实现双向保护。 内置式集菌仪等 成模块，数据完整性、审计追踪National Ins tutes for Food and Drug Control日常使用维护 实验前后用杀孢子剂对手套及关键部位进行消毒 手套检漏应有程序化规定 带双层手套操作 纤维制品避免直接放入隔离器内 手套更换周期应有验证基础（持续使用时间/依赖手套检漏） 表面/环境微生物监控建议每次实验进行 严格遵照CD程序进行物品装载National Ins tutes for Food and Drug Control关键区域灭菌暴露 验证包装完整性 保证高

22、风险区域的灭菌暴露预防性维护程序 根据使用频次，考虑制定维护、校准及再验证计划 重点确认项：压力、温度、灭菌前湿度、VHP浓度 定期进行完整性测试 报警系统的维护与确认 依据不同报警级别进行相应的评估、调查、记录 手套完整性测试的周期性制定National Ins tutes for Food and Drug Control手套检漏 每次试验前后？ 一周/一个月/一个季度 手套更换频率操作人员要求 经过系统培训，充分了解设备性能 严格遵照确认过的工作循环程序 能意识到并预判风险，并做好预防性措施（ 何种操作容易导致手套破损等） 无菌操作技术仍然至关重要 操作过程 使用经过灭菌的工具 装载量与

23、装载模式的恶劣性不超过验证模式National Ins tutes for Food and Drug Control无菌操作保障基本的无菌操作仍然至关重要适当的辅助设备安瓿开瓶器主要验证环节环境空气表面培养基方法无菌性灵敏度制备过程检查过程National Ins tutes for Food and Drug Control在硫乙中生长差异需氧层厌氧层均生长仅在需氧层生长仅在厌氧层生长l铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginoCMCC(B) 10104l大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 44102l枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis

24、)CMCC(B) 63501l生孢梭菌( ostridium sp rogenes)CMCC(B) 64941l金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26003National Ins tutes for Food and Drug Control微生物实验室常用菌株l 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10104G-杆菌l 大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 44102兼性需氧菌专性厌氧菌l 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMC ) 26003G+球菌l

25、 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64941l 枯草芽孢杆菌 acillus subtilis) G+芽孢杆菌CMCC(B) 6350l 白色念珠菌 ndida albicans) 酵母菌CMCC(F) 98 1专性需氧菌l 黑曲霉 ( spergillus niger)CMCC(F) 98003霉菌National Ins tutes for Food and Drug Control方法适用性内容修订National Ins tutes for Food and Drug Control培养基适用性检查USP:compare to that prev

26、iously obtained with a previously tested andapproved batch of medium occurs. 之前验证过的Microbi ogical Examination of Nonsterile P oducts: Microbial Enumeration Tests：Growth Pormotion ofthe Media。 Microbiologica Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms：GrowthPormotion aInhib

27、itory Properties of the Media. Test each batch of ready-prepared medium and eachbatch of medprepared either from dehydrated medium or from ingredients. For a freshly prepared inoculum,growth of he microorganisms compar ble to that previous y o tained with a previously tested andapprov d batch of med

28、ium occurs. 我国药品微生物实验室小而分散，数以千计的企业和基层药检所难以有效地进行参比培养基的验证、评价 ； 在监督检查中，难以有效评估企业微生物实验室对参比培养基的验证情况。National Ins tutes for Food and Drug Control对照培养基单剂量免称量独立包装专利号：ZL200920108836.8培养基质量控制：USP之前验证过的中国药典对照培养基待测培养基平均菌落数 （cfu）*100%对照培养基平均菌落数 （cfu）回收率 50%200%National Ins tutes for Food and Drug Control主要验证环节环境空

29、气表面培养基方法无菌性灵敏度制备过程检查过程National Ins tutes for Food and Drug Control药典方法需做适用性试验US FDA cGMP 法规在 21 CFR 211.194 (a (2) 中规定：“如果应用的方法收载于现行的美国药典或其他认可的标准方法中，或在批准的新药应用中有详细方法且未改变这一参考方法时， 明方法和参考文献的声明即满足要求。所有检测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实。”Ludwig HuberValidation and Qualification in Analytical LabNew York, USA, 2007ries

30、National Ins tutes for Food and Drug Control方法适用性接种法、薄膜过滤法均为药典方法方法适用性针对环节：样品制备过程：表面活性剂、中和剂的微生物无毒性处理方法的微生物兼容性样品检查过程：可用的去除活性或中和活性的方法Suitabil ty test based on Recovery ValidationNational Ins tutes for Food and Drug Control方法适用性的一般程序与环节利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。需前处理验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。样

31、品有抑菌作用 去除抑菌作用验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。可以通过验证实验判断不需 处理无抑菌作用检查药品微生物检查方法适用性检查的一般程序与环节National Ins tutes for Food and Drug Control疑难问题含卡波姆（聚卡波菲）的滴眼液微球类注射剂Nationa含卡波姆的滴眼液卡波姆是由丙烯酸与丙烯基蔗糖交联而成的高分子聚合物，可溶于乙醇、水和甘油。分子结构中含50%以上的羧基基团，因此具有一定的酸性，可用氢氧化钠、碳酸氢钠等碱性物质中和。卡波姆被中和使羧基离子化后，由于负电荷的相互排斥作用，分子链弥散伸展，呈极大的膨胀状态，并具有粘性，可形成澄清的粘稠的凝胶。National Ins tutes for Food and Drug Contro