邓云峰-结核病核酸检测技术

1、2018-5-14全球结核病疫情概览估算发病率 估算发病人 发病数占全数球比例结核病核酸检测技术全球142/10万195/10万64/10万1040万905万高负担国家中国87.1%89.5万8.6%（全球3位）耐多药/利福平耐药结核病邓云峰结核病患者中比例估算发病 发病数占全人数球比例新患者3.9%复治患者21%全球600 000520 00073 000-山东省胸科医院高负担国家中国4.3%7.1%22%24%90%山东省呼吸病与结核病防治研究中心12%（全球2位）2016年报告发病率（数）不同职业报告肺结核患者构成发病数居前10位省份人口数占全国的47.7%发病数占全国57.8%2016

2、年： 农牧渔民比例最高，占65.5% 其次为家务及待业者，占12.1% 再次为离退休，占4.5% 学生所占比例为3.8%结核诊断的常见技术抗酸杆菌检查传统技术现代技术n涂片 直涂厚涂离心浓缩影像学涂片镜检培养皮肤菌素试验IGRA分子诊断n染色 萋尼氏荧光法n镜检 双目荧光LED 自动阅片可诊断活动期结核无法区分活动期结核与潜伏期结核 感染12018-5-14分枝杆菌分离培养与药敏试验当前临床诊治的难点n固体培养基依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性nnn 改良罗氏培养基 琼脂培养基（7H10,7H11）n液体培养基敏感性为50%结核/非结核分枝杆菌不能区分（ NTM可能占到40%） Midd

3、lebrook 7H9以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响n自动化培养设备 BACTEC MGIT 960 BacT/ALERT 3D2个月才获得药敏结果，导致患者脱落2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播 Versa TREK/ESP II无法更早确诊耐药结核患者“十三五”结核病规划指标我国结核传染源的发现现状“十三五”规划指标目标值报告肺结核患者和疑似肺结核患者的总体到 95%以上位率病原学检查阳性肺结核患者的密切接触者筛 95%查率达到肺结核患者病原学阳性率50%以上95%以上耐多药肺结核高危人群耐药筛查率肺结核患者成功治疗率90%以上2016年全球30个高负担国家细菌学确诊

4、病例所占比例（ %）高负担国家的耐药结核发现最新的两个行业标准我国当前耐药结核防控的问题：nn结核病分类WS196-2017不充分的耐药病人发现 ，不充足的耐药病人治疗肺结核诊断WS288-2017 2018年5月1日实施 分子检测成为确诊依据5.56%纳入治疗22018-5-14十三五结核病防治规划环介导等温扩增设备要求较低1.加强技术培训和质量控制操作复杂，人工判读结果技术培训和技术指导痰涂片室间质评药敏熟练度测试分子诊断及耐药基因检测的室间质评2.新诊断技术推广应用新诊断工具的物价审批逐步纳入基层医疗保险范围3. 逐步推广新诊断技术地市级县区级l结核分枝杆菌及是否对利福平和异烟肼耐药l基

5、因芯片l检测结核分枝杆菌l环介导等温扩增l多色巢氏荧光PCR法l交叉引物法l溶解曲线l线性探针lRNA等温扩增法恒温扩增 试纸条法实时荧光RNA恒温扩增检测技术RNA检测技术，高灵敏度，可区分活菌和死菌，适用于疗操作步骤：效监测1. 将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增模板液2. 取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置中扩增需配备超声波仪，且仍需要实时荧光 PCR仪检测无耐药检测WHO未评估或推荐3. 使用水浴锅或金属浴；63扩增1小时；4. 将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增物试纸条检测装置中检测 , 15分钟目测定性结果手工操作步骤相对较少无需昂贵的仪器无耐药检测手工

6、操作相对较少WHO未评估或推荐半巢式实时荧光PCR（Xpert）最直观的诊断报告PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域：5个探针结合到野生型，而不是突变体目标系统内自动完成结果解释痰标本与处理液1：2混合分子信标样本及测试信息DNA反应和半巢式实时荧光定量核酸扩增检测标本自动清洗过滤超声裂解DNA提纯PCR试剂混合靶序列杂交体吸取2ml处理样品到反应盒打印检测报告实时 PCR扩增曲线将反应盒放入检测模块（手工操作完成）每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。获得检测结果时间：1小时45分钟|32018-5-14WHO关于Xpert MTB/RIF的推荐和指南2014 WHO关于结核诊断

7、的标准政操专策作家肺结核n性性共文文识所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做涂片镜检 或 1份痰做件件Xpert MTB/RIF检测；当患者具有耐药结核的风险，或者合并HIV感染，或者病情严重时，应使用XpertMTB/RIF做初始诊断；对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF或培养进行诊断基于血标本的血清学检测或 -干扰素释放试验不能用于活动性结核的诊断结结结核核核报关实告怀验新n肺外结核所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核 时，应当采集相应的样本进行微生物学和组织国室框际安架标全学检查；优先推荐使用Xpert MTB/RIF做初始诊断准手册n对于耐多药结核

8、的高危人群，应使用 Xpert MTB/RIF进行初始诊断疾病分类Xpert作为诊断指标说明疾病分类Xpert作为诊断指标说明肺外结 泌尿系统结核核尿液Xpert MTB/RIF 检测法具有敏感性和特异性高以及快速等优点，是诊断泌尿系统结核的重要新方法；肺结核 原发性肺结核病Xpert MTB/RIF 阳性，可以确定诊断；Xpert MTB/RIF 检测法具有重要价值；血行播散性肺结核生殖系统结核进行Xpert MTB/RIF 检测对男性生殖系统结核的诊断具有重要价值。继发性肺结核诊断继发性肺结核的重要手段，此外， Xpert MTB/RIF 检测法还可检测利福平耐药基因 rpoB 的突变用于

9、诊断利福平耐药结核病；其他部位结核特殊人 老年结核病群结核气管、支气管结核痰抗酸杆菌阳性或结核分枝杆菌培养或 Xpert MTB/RIF 阳性；儿童结核病WHO 推荐的Xpert MTB/RIF 检测法在儿童结核病中的诊断具有重要价值；肺外结 结核性胸膜炎核是诊断结核性胸膜炎的重要方法；妊娠结核病Xpert MTB/RIF 检测法在诊断妊娠结核病也具有重要价值。结核性脑膜炎结核性心包炎结核性腹膜炎肠结核可以明显提高结核分枝杆菌的阳性检出率；心包液Xpert MTB/RIF 检测法可明显提高阳性检出率腹腔积液Xpert MTB/RIF 检测法具有重要价值结核病 结核病与糖尿病和其他疾病结核病与矽

10、肺是诊断硅沉着病结核的重要手段；在HIV/TB 患者具有重要的诊断价值；Xpert MTB/RIF 检测阳性有确诊意义；结核病与艾滋病淋巴结结核淋巴结穿刺液或脓液行Xpert MTB/RIF 检查为淋巴结结核一种新的重要诊断手段，具有敏感性高、特异性强和快速等优点，值得推广应用；结核病与其他免疫缺陷病耐药耐药结核病在怀疑患者有原发耐药的重症肺结核时可考虑应用，当Xpert试剂盒临床验证山东胸科Xpert试剂盒临床验证山东胸科XpertMTB检测结果与临床诊断的一致性分析 本次临床试验共入选523例样本，其中4例样本由于数据不全被剔除，最终纳入统计学分析的样本数共519例。临床诊断Xpert M

11、TB合计检测结果肺结核非肺结核阳性阴性合计2051573622207293500 519例有效样本中，其中临床诊断为肺结核的患者样本362例， 临床诊断为非肺结核的患者样本138例，临床诊断不明确的患者样本19例。136138阳性符合率56.63，95 CI 51.35（，61.80 .）阴性符合率98.55，95 CI（94.86，99.82）.42018-5-14Xpert试剂盒临床验证山东胸科Xpert试剂盒临床验证山东胸科nXpertMTB和培养+鉴定结果的一致性分析XpertMTB与抗酸染色镜检结果的一致性培养+鉴定结果Xpert MTB检测结果合计Xpert MTB涂片结果合计阳性

12、阴性检测结果阳性阴性62阳性阴性合计1861421207312519阳性阴性合计1434205157298319153215200147362)阳性符和率93.00，95CI（88.53，96.12）.阴性符和率93.42，95CI（90.11，95.88）.总符和率= 93.26，95CI（90.75，95.26）.涂片阳性肺结核: Xpert 检出率=97.28， 95CI（93.18，99.25）涂片阴性肺结核: Xpert 检出率=28.84， 95CI（22.88，35.39）Xpert试剂盒临床验证山东胸科Xpert试剂盒临床验证山东胸科nXpertMTB与达安MTB检测的一致性分

13、析Xpert利福平耐药与药敏试验结果的一致性达安检测结果Xpert rpoB 基因突变Xpert MTB 检测结果合计利福平药敏试验合计检测结果耐药410敏感阳性阴性突变不确定无突变合计5461阳性192152071阴性合计9303318312519213714213918543201阳性符合率95.52，95 CI（91.67，97.93).阴性符合率95.28，95CI（92.34，97.34）.总符合率95.38，95CI（93.20，97.02）.阳性符合率 95.35，95CI（84.19，99.43）.阴性符和率 96.48，95%CI（91.97，98.85）.总符合率 96.2

14、2，95CI（92.36，98.47）.Xpert试剂盒的临床应用山东胸科Xpert试剂盒的临床应用山东胸科GeneXpert MTB/RIF分枝杆菌培养阳性 NTM涂片荧光镜检临床诊断结核病肺结核 痰(n = 192)GeneXpert分枝杆菌培养荧光涂片镜检三种方法联合标本类型 不确定阴性98阳性阴性0污染阴性0阳性痰(n=229)10103300112115167.7% (130/192)12.3% (10/81)65.1% (125/192)14.8% (12/81)61.5% (118/192)1.2% (1/81)69.8% (134/192)23.5%(19/81)8264121

15、8900086159010脑脊液(n = 81)13010脑脊液(n=101)91836胸水(n = 95)组织 (n = 18)尿(n = 9)16.8% (16/95)61.1% (11/18)22.2% (2/9)34.7% (33/95)5.6% (1/18)3.2% (3/95)33.3% (6/18)11.1% (1/9)0% (0/7)38.9% (37/95)61.1% (11/18)33.3% (3/9)40胸水(n=124)10811874211200001081303161122.2% (2/9)组织样本(n=22)111001000011506腹水(n = 7)所有肺外

16、样本(n = 210)14.3% (1/7)28.6% (2/7)28.6% (2/7)尿(n=21)19.0% (40/210)23.8% (50/210)5.2% (11/210)34.3% (72/210)198190020000190000003318210201腹水(n=9)7180Total (n = 402)42.3% (170/402)43.5% (175/402)32.1% (129/402)51.2% (206/402)0110合计(n=506 )10001Xpert MTB/RIF试验诊断肺结核病的有具有较好的敏感度，肺外结核敏感度低，无论是肺结核还是肺外结核，三种方法联

17、合使用敏感度高于单一使用一种诊断技术。与其他两种方法相比 XpertMTB/RIF试验更适合于组织样本检测。33528926341413214614124170Xpert试验与非结核分枝杆菌无交叉反应，可以通过 Xpert MTB/RIF试验来排除非结核分枝杆菌感染。52018-5-14熔解曲线技术MeltPro TB操作界面核酸提取扩增检测结果原理：一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时， Tm值也一定，发生错配时，Tm值下降，下降幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关2-3小时获得结果，目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药等五套试剂盒WHO未评估或推荐配套设备：核酸提取仪、PCR仪

18、等MeltPro 耐药结核检测: 覆盖位点MeltPro TB 系统: 注册状态CFDA注册证乙胺丁醇利福平异烟肼氟喹诺酮链霉素CFDA注册中注射类二线药+ 吡嗪酰胺， NTM, NAT-2多中心验证（2013-2015年）MeltPro TB利福平耐药检测性能盖茨基金会结核病防治项目中国疾病预防控制中心结核病国家参比实验室广州市胸科医院山东省胸科医院验证对象：GeneXpert和Genotype MTBDR的灵敏度分别为87.10%和88.3%，低于本次研究中MeltPro TB RIF的94.2%。厦门致善MeltPro TB 利福平、异烟肼、氟喹诺酮和注射类二线药耐药突变检测试剂Sci.

19、 Rep. 6, 25330; doi: 10.1038/srep25330 (2016)62018-5-14MeltPro TB异烟肼耐药检测性MeltPro TB耐多药结核检测性能MeltPro TB 检测耐多药结核的灵敏度和特异性分别为 86.7%和97.7%。Sci. Rep. 6, 25330; doi: 10.1038/srep25330 (2016)由于覆盖了ahpC启动子区，MeltPro TB INH的灵敏度（84.9%）高于Genechip 和 Genotype MTBDR的灵敏度（80.34%和80.2%）。Sci. Rep. 6, 25330; doi: 10.1038

20、/srep25330 (2016)各类分子诊断技术比对MeltPro TB氟喹诺酮耐药检测性能（液体培养/DST为金标准）线性探针基因芯片恒温扩增（试纸条法）RNA恒温扩增LAMP熔解曲线X p e r tMTB/RIF结核及耐药结核初始诊断是否WHO推荐仪器通量耐药结核诊断否否否否否12（手工）6或12（选用杂交仪可同时做12个样品）单个2小时通量取决于扩增仪2小时纯手工操作20或48（自动）961-80出报告时间6小时6小时2小时2-3小时2小时试剂储存条件部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻 部分试剂需冷冻 部分试剂需冷冻室温储存部分试剂需冷冻室温储存涂阳培阳样本MTB灵敏度无无无无84.1%5

21、9.8%5584.6%61.9%6698.2%55.6%7780%81%8898%3涂阴培阳样本MTB灵敏度68%3-88.8%2RIF：93.1%-98%1INH：85%3RIF：91.8%-94.6%4INH：70.2%-78.1%4RIF：90.9%-96.4%9INH：81.0%-88.1%9FQ：78.2%-87.5%9耐药灵敏度无无无RIF 95%3MeltPro TB 检测氟喹诺酮耐药的灵敏度和特异性分别为 83.3%和98.1%。Sci. Rep. 6, 25330; doi: 10.1038/srep25330 (2016)1.2.3.4.5.6.7.8.9.陈琛等 . 分子

22、线性探针测定法杖结核病诊断中的研究进展Xichao Ou et al. feasibility study of the Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Disease. 2015 (31): 41.WHO. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children Policy Update.Guo, et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using biochip system. International Journal of Infectious Disease. 2009 (13): 914.Xichao Ou et al. multicenter study of Cross-