定量PCR的技术原理

1、定量PCR的技术原理王争强Hotline: 400 620 9660cnmcbsupport内容提要定量PCR的发展历史定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.内容提要定量PCR的发展历史定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.定量PCR的发展历史1996年：世界上第一台定量PCR仪7700型1997年：推出5700型定量PCR仪，面向医院用户2000年：推出7900型38

2、4孔定量PCR仪2001年：推出7900型96孔定量PCR仪2001年：推出7000型96孔定量PCR仪2004年：获得定量PCR仪专利2004年：推出7300和7500定量PCR仪2007年：推出StepOne和StepOnePlus定量PCR仪 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.定量PCR的发展历史 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.定量PCR的发展历史7500Fast75007900HT7300StepOne/StepOnePlus 2009 Applied Biosystem

3、s. All Rights Reserved.内容提要定量PCR的发展历史定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.什么是PCR？链式反应的雪崩效应模板、引物、dNTP、缓冲液、镁离子、DNA 聚合酶5355335535F55primer355335555R5primer3553535553355353555353553353553535 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.起点定量与终点定量相同样品进行96次扩增，由于PCR扩增效

4、率的差异，扩增结果存在很大的差异 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR动力学曲线和四个阶段线性图谱平台期线性增长期指数增长期基线期平台期线性增长期指数增长期对数图谱基线期 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR动力学曲线和四个阶段平台期线性增长期指数增长期对数图谱线性图谱 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.什么是基线？基线就是扩增曲线的水平部分线性图谱对数图谱 2009 Applied Biosystems. All Ri

5、ghts Reserved.什么是阈值？基线（空白）信号的产生是由于环境的噪音引起的默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.基线的设定 实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15 如果CT值18，保持默认 如果C 值18，基线终点改成最小的C 值-3，重新分析TT 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR扩增的数学模型扩增产物遵循理论方程：Y=X(1+E)nY=扩增产物，X=起始浓度，E=扩增效率，n=循环数指数增长期 2009 Applied

6、 Biosystems. All Rights Reserved.Ct值与起始浓度的关系nR =R + X (1+E) Rn B 0s第n次PCR循环时的荧光信号强度(R )等于背景信号强度(R )加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，R )SnB与分子数目的乘积。设n=Ct，则：R = R + X (1+ E)Ct RsCtB0log (R - R ) = log X + C log (1+ E) + log RsCtB0tC log (1+E) = - log X + log (R - R ) log Rst0CtBlogXlog(R R ) logRCt S0BCt = +log(1+

7、 E)log(1+ E)Ct = - k lg X0 + b （线性方程） 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.标准曲线Ct值C = - k lgX + bT0lg 起始浓度的 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.斜率Ct=-klgX0+b 斜率=-1/lg(1+e) E=1, 斜率=-3.32 斜率范围：-3.1和-3.59之间理想条件下 浓度增加1倍，Ct值减小1 浓度增加10倍，Ct值减小3.32 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserv

8、ed.理想的扩增结果 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.内容提要定量PCR的发展历史定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.荧光基团发光原理Light荧光基团发光原理：在一束特定波长（如500nm）激发光源的作用下，荧光基团的电子向高能级跃迁，随后从高能级跃迁回较低的能级，释放特定波长的光（如600nm），这个光称为发射光。由于电子从高能级跃迁回来的时候会损失部分能量，所以发射光的能量会比激发光能量小，结果就是发射光的波长比激发

9、光波长向红外移动（紫外能量大，红外能量小）。 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.常用荧光标记方法探针 TaqMan TaqMan-MGB染料 SYBR Green I Syto 9 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理一对PCR引物 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理引物之间一条寡核苷酸，称作探针 2009 Applied Biosystems. All Rights Res

10、erved.TaqMan水解探针作用机理报告基团淬灭基团 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理荧光共振能量转移(FRET)当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量转移

11、给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET）激发光无荧光信号产生能量 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理Light energy 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理变性 (95C) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理退火 (60C) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMa

12、n水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMa

13、n水解探针作用机理? 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理Taq is special . . . 5-3外切酶活性 将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理

14、 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理

15、 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理

16、 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理

17、 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.TaqMan水解探针作用机理Burp! 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.SYBR Green I作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.SYBR Green I作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.SYBR

18、Green I作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.SYBR Green I作用机理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.SYBR Green I作用机理 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 染料一结合，就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.熔解曲线Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性PCR过程中，控制

19、温度缓慢升高 ，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号减弱对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即Tm. 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.熔解曲线只有染料法才需要做融解曲线，探针法没必要 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.熔解曲线 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.多重定量 原理同一样本，多对引物和探针，分别扩增不同靶基因。不同的探针标记不同的荧光素，发出不同颜色的光，识别不同的靶基因 特点一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因 目的提高效率，节省时间降低研究成本 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.荧光染料组合报告荧光: 6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas Red、CY5淬灭荧光: TAMRA、BHQ、NFQ参比荧光: ROX推荐的4色组合：FAMVICNEDROX目的基因1目的基因2/内对照目的基因3参比荧光 2009 Applied Biosystems. A