靶向肝脾巨噬细胞治疗血小板减少性紫癜的实验研究

1、靶向肝脾巨噬细胞治疗血小板减少性紫癜的实验研究【关键词】免疫性血小板减少性紫癜二氯亚甲基二膦酸盐明胶微粒巨噬细胞experientalstudyfrthrbytpenipurpuratherapybytargetingarphagesinliverandspleendepartentfnulearediine,ruijinhspital,theshanghaijiatnguniversity,shanghai200025,hina;keylabratry,divisinfeduatinnpreparatinandappliatinfsuperfineaterials,huadngunivers

2、ityfsieneandengineering,shanghai200237,hinakeyrdsiunethrbytpenipurpura;dihlrethylenediphsphnate;gelatinpartile;arphage;targetingtherapyjexpheatl2022;15(1):103-107主要试剂细胞株和实验动物ra264.7巨噬细胞株为中国科学院上海细胞生物所保存株。sd大鼠、新西兰大白兔购自上海第二医科大学附属瑞金医院动物房。明胶微粒对药物的包封、肝脾靶向性和生物相容性研究在我科实验室进展，载药l2dp量为5g/g明胶微粒。巨噬细胞的tt试验细胞培养巨噬细

3、胞株ra264.7常规复苏后以含10%fs的de培养液于37、5%2中孵育24小时。移去培养液及未贴壁细胞，再参加培养液继续孵育至细胞长满培养皿底。以0.25%胰酶+edta消化30秒，制成细胞悬液传代，至细胞长满培养皿底后再次制成细胞悬液进展tt试验。细胞抑制率=对照组d值-干预因素组d值/对照组d值100%。兔抗鼠血小板血清的制备别离血小板sd大鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血，全血与抗凝剂3.8%柠檬酸钠之比为91。室温，125g离心10分钟，无菌下移取上层富血小板血浆2000g离心20分钟，移除上层血浆；沉淀的血小板以0.05l/lph7.4的pbs洗涤2次，生理盐水悬浮，取少许稀释后计数。免

4、疫用sd大鼠血小板耳缘静脉注射免疫新西兰大白兔，每只约1109个血小板，分别在首次免疫后的第15、30、40天时重复免疫1次。提取抗血小板血清末次免疫后10天，5%巴比妥麻醉，颈动脉插管预先以肝素潮湿管壁取血。兔的全血于室温下放置1小时后移至4冰箱过夜，然后4、2000g离心20分钟，然后于无菌条件下移取上层血清分装，-20冻存备用。itp模型的建立7，8为了防止所使用的igg聚合引起部分阻塞，采用未经处理的兔抗鼠血小板血清代替纯化抗体建立itp模型。单次不同剂量注射抗血小板血清50、100、150、200、300l，以sd大鼠血清稀释至500l后静脉注射，每组5只，另取5只静脉注射普通兔血清

5、500l为对照。分别于注射前0小时、注射后4、24、48、72、96小时取血进展血小板、白细胞和红细胞计数。屡次同一剂量注射鉴于150l组的血小板计数于静脉注射后4小时降至最低为38.84.8109/l图1，且不至引起实验动物死亡。取sd大鼠5只，每24小时重复静脉注射抗血小板血清150l，在一样的时间点取血进展血小板计数。出血时间测定抗血小板血清注射后24小时在sd大鼠的尾巴上，用无菌刀片切出深约3与尾静脉平行的创口注意避开能目睹的静脉，每隔30秒用滤纸吸去出血直到出血完全停顿，记录这期间的时间。上述各组分别在首次计数后24、48、72、96小时取血进展血小板计数，并在24小时按前述方法测定

6、出血时间。统计学处理采用sas6.12统计软件，血小板计数以sd表示，进展t检验。结果tt试验sd大鼠itp模型单次不同剂量注射sd大鼠静脉注射抗血小板血清后血小板计数的变化见图1。在50、100、150l剂量组，注射后4小时血小板计数逐渐下降至最低，分别为92.57109/l、61.78.3109/l、38.84.8109/l，其后逐渐上升，至48小时恢复正常程度。对照组的血小板计数未见明显变化，各组红细胞和白细胞计数均未见明显异常变化。此外，200l组中于注射抗血小板血清后4小时内有2只动物死亡，存活的3只鼠4小时血小板计数为14.82.9109/l，300l组动物全部死亡。解剖发现死亡鼠

7、的内脏如肝、脾、肺及心包等存在程度不等的出血点或出血。屡次同一剂量注射150l抗血小板血清每24小时重复静脉注射后血小板计数的变化见图2。图中对照组和单剂量组引用图1中数据。结果显示每24小时重复静脉注射1次150l抗血清，可以使sd大鼠的血小板计数维持在低于50109/l的病理程度与对照组比拟，p0.01。出血时间对照组sd大鼠的出血时间均2分钟n=5，而实验组的出血时间均3分钟n=15，显示由抗血小板血清静脉注射引起血小板下降后，也相应的导致出血时间明显延长p0.01。讨论治疗itp的靶向药物输送方法早在1978年已有报道9，ahn等9使用载有长春碱的血小板作为巨噬细胞的“特洛伊木马，希望

8、药物进入细胞后再释放出来杀死巨噬细胞，但其研究未达预期目的。直到有研究者开展了一种被称为巨噬细胞“自杀技术的研究方法10，这一itp的治疗策略才重新引起了人们的关注。这种方法现已成为研究生理或病理状态下巨噬细胞功能的常用手段，并开场研究用于治疗一些以巨噬细胞为药物作用靶点的疾病如itp、aids等。建立动物itp模型的方法主要有3类，化学药物诱导、使用抗血小板抗体单克隆抗体或多克隆抗体制备或使用有自发发生自身免疫性疾病倾向的动物种系7，8，11，12。本实验使用抗血小板抗体建立sd大鼠itp模型，单次注射一定剂量的抗体所导致的血小板减少仅持续不到24小时，至48小时已恢复正常程度。而通过每24

9、小时重复注射150l抗血小板血清，可以维持血小板计数持续50109/l，出血时间延长到4分钟正常2分钟，而红细胞和白血胞计数未见明显降低，符合itp的实验室检查表现，这说明模型的建立是成功的。但临床上除儿童itp多表现为急性外，成人itp大多起病缓慢，而通过注射抗体建立模型从病理上看应属一种急性的疾病发生过程，因此这种动物模型能否反映成人itp的病理特征尚需进一步研究。l2dp是临床上治疗骨质疏松和肿瘤骨转移的常用药物，为水溶性，难以通过细胞膜，将其与300-500n的明胶微粒连接，那么可通过肝脾巨噬细胞对明胶微粒的摄取而进入细胞内发挥治疗作用。目前药物的杀伤细胞或抑制细胞活性的机制尚未完全清

10、楚，但现有研究已证实此药对吞噬细胞巨噬细胞、破骨细胞等有毒性作用13。在以脂质体为载体进展的靶向巨噬细胞的动物研究中，研究者认为它的作用机理是：抑制或干扰细胞的物质代谢如溶酶体酶等的合成与能量代谢形成不能水解的atp类似物；影响单核吞噬细胞分泌细胞因子的种类和量，抑制干细胞的分化和成熟细胞的功能；在体外可诱导肿瘤细胞骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等和巨噬细胞凋亡等14。但本实验中l2dp产生疗效确实切机制及其对全身免疫功能的影响还有待明确。我们的实验结果和文献资料7，8均说明，使用明胶微粒作为l2dp的载体将其定向输送到肝脾巨噬细胞治疗itp是可行的，尤其对急性发作所致血小板迅速下降可能导致的出血有较好的治疗与预防作用，同时还可防止常规治疗中伴随的药物毒副作用较大的缺点。尽管目前的资料尚不能