细胞总脂肪酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

1、Word文档 细胞总脂肪酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书 主要用途 细胞总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解，释放出巯基基团，使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采纳比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过细心改良、胜利试验证明的。其适用于各种细胞裂解样品（动物、人体、植物、昆虫等）脂肪酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂质分子的酯键（ester bond）的水解。在人体

2、中，其来源于胰腺产生。在消化系统中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），产生1个分子甘油（glycerol）和3个分子游离脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶特别增高与胰腺炎、胰腺管堵塞、胰腺癌、肾病、唾液腺炎症、肠道堵塞等相关；特别降低则与胰腺中脂肪酶产生细胞的性损伤有关。脂肪酶的活性检测是临床诊断的指标之一。基于脂肪酶在水分子的参加下，催化三丁酸二巯基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，产生二巯基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并释放出巯基基团（SH

3、），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）5,5-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其汲取峰值的变化（412nm波长），来定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 反应液（Reagent D） 毫升 底色液（Reagent E） 毫升 补充液（Reagent F） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存反应液（

4、Reagent D）和底色液（Reagent E）在20冰箱里，其余的保存在4冰箱里；底色液（Reagent E）避开光照，有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 细胞刮脱棒：用于脱离铁壁细胞 DOUNCE匀浆器：用于组织裂解 微型台式离心机：用于样品制备 恒温水槽：用于孵育反应 比色皿或96孔板：用于反应和比色的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 试验步骤 一、样品预备 1预备好25cm2细胞培育瓶或60mm细胞培育皿的待测培育细胞（1至5 X 106细胞） 2当心加入xx毫升清理液（Reagent A），掩盖生长表面 3当心

5、抽去清理液 4使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（留意：可以使用胰酶消化） 5加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞 6移入到预冷的15毫升锥形离心管（留意：悬浮细胞从这一步骤开头） 7放进4台式离心机离心5分钟，速度为300g 8当心抽去上清液 9加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀 10涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群 11即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器 12在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下） 13将全部细胞匀浆物移入1.5毫升离心管 14移取10微升进行蛋白定量检测（留意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1） 15即刻放进70保存或置于冰槽里

6、连续后续操作 二、测定预备 1预备好待测样品，置于冰槽里 2设定好分光光度仪（温度为37）：波长412nm，间隔10分钟，读数4次（共30分钟），并置零 3缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度 三、背景对比测定 1移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2加入xx微升底色液（Reagent E） 3上下倾倒数次，混匀 4在37温度下孵育3分钟 5加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（留意：样品须清亮） 6上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内） 7即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对比（30分钟读数0分钟读数） 四、样品测定 1移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的

7、比色皿 2加入xx微升反应液（Reagent D） 3加入xx微升底色液（Reagent E） 4上下倾倒数次，混匀 5在37温度下孵育3分钟 6加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（留意：样品须清亮） 7上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内） 8即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数0分钟读数） 五、计算样品活性 六、酶标仪测定 1在96孔板上做好相应标记：背景对比和样品 2分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到全部孔里 3加入xx微升反应液（Reagent D）到样品孔里 4加入xx微升阴性液（Reagent F）到背景对比孔里 5分别加入xx微升底色液（Reagen

8、t E）到全部孔里 6轻轻摇动96孔板 7在37温度下孵育3分钟 8分别加入10微升待测样品（或20微克蛋白）到全部孔里（留意：样品须清亮，且pH为7.2） 9轻轻摇动96孔板 10即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和30分钟读数） 11活性计算 留意事项 1本产品为50次（96孔板，包括50次样品和50次背景对比）和12次（比色皿，包括12次样品和12次背景对比）操作 2本产品检测范围是40至1600毫单位/毫升 3操作时，须戴手套 4每次样品测定，需要背景测定一次 5样品须澄清，至关重要 6样品中避开含有EDTA、TWEEN20、NP40、巯基乙醇、DTT等，否则干扰检测 7孵育反应完成后即刻进行比色测定 8比色测定后，比色皿须清洗彻底 9建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升（本公司供应 Br