麻风病复发的微生物学和免疫学检测(诊断)

1、麻风病复发的微生物学和免疫学检测（诊断）中国医学科学院皮肤病研究所吴勤学2008.9写在前面麻风病命名与麻风杆菌麻风病复发定义及原因麻风复发的监测和检测展望与推荐写在前面说癞麻风病是由麻风杆菌引起的慢性传染病，是皮肤病的一种，亦称癞。由于本病严重者可致面部毁容和四肢畸残，给人以丑陋的外貌，人皆惧之。古时由于不能解其病因而讹传为道德败坏，祖上缺德，视为“天谴”，人皆唾之。终遭致麻风患者被歧视、迫害，甚至火烧、活埋乃至枪杀，其惨无比，人皆恐之。即使不如此，由于怕传染，也要隔离，麻风村（院）不是建在深山，就是孤岛，抑或江滨，基本上与世隔绝，生活上苦不堪言，人皆畏之。 麻风病控制已经取得了令人瞩目的成

2、绩，尤其在采用标准联合化疗（MDT）方案后。但在看到成绩的同时必须正确地对待和科学地加以分析：就全球而言，计算麻风达标是以全球人口作为分母，而实际上麻风病在许多发达国家已几乎不存在。在我国达标亦是以全国人口作分母的。所以是人为的统计学的指标，未能完全反映问题的实质；某些国家2000年底并没达到消灭的目标（我国有的省、地区亦然），在2005年(即使2008)这一目标仍然难以达到；历史的回顾：成就现状未来写在前面所谓的消灭，只是表明登记病例的患病率的降低，它不等于实际患病率的降低。因为某些国家卫生服务人群覆盖率远远低于100%，导致某些地区大量病人未被发现，即使卫生服务覆盖较好，亦仍存在发现不足和

3、延迟发现的情况；即使在登记患病率低于1/万的某些国家，麻风仍然是重要的公共卫生问题。因为不论从国家水平、还是从省、州、县级水平上看，都存在着大量病人尚未发现和患病率仍然保持在高水平，发病地区不平衡，我国目前云、贵、川、藏就是这样情况。国外主要集中在印度、巴西、缅甸、印度尼西亚、马达加斯加和尼泊尔；过去的15年中每年新发病人数已趋稳定，1998年后稳中有降；但某些国家和地区新发病人数仍呈上升之势。 这些告诉我们：实际患病率与登记的患病率可能有很大的不同；虽然登记患者数已明显下降，但全球新病人发现率并未减少。此外，尚无有证据表明，一旦患病率降到预先规定的水平，麻风病将会自然消灭。结论 很可能会有显

4、著数量的新病人在今后很多年内继续出现，即使在那些已达到规定消除目标的国家和/或地区麻风控制活动亦必须确保继续进行。 麻风病麻风病的命名麻风病病原体麻风杆菌麻风病的病名麻风病是一古老的慢性传染病，其病名多种多样Set （埃及） Zaraath （西伯来文圣经）Leprosy （英、美） Aussatz （德国）Judham （阿拉伯语） Kushtha （印度）癞病 业病 例外 傍居 （日本）疠 疠风 厉 大风 癞疾 癞病 癞 恶疾 天刑 麻疯 癞风 大麻疯 麻风 （我国 ）现统称：leprosy（麻风） 或Hansen disease（汉森病）麻风病病原体麻风杆菌（1）Mycobaterium

5、 leprae，ML，麻风菌 Hansen 1873年发现，1974年公开发表 放线菌目，分枝杆菌科，分枝杆菌属，唯 侵人、动物N 比Mtb发现早9年 体外尚不能人工培养，有动物模型麻风病病原体麻风杆菌（2）ML一般特征ZN染色（+）、G+ZN染色光镜下：长18m ，宽0.3 0.4m ，短小直棒状或略弯曲，无鞭毛、芽孢1条菌重：3.91.0（SD）10-14克基因组：2.8Mb，能编码1600种蛋白，比Mtb低，有假基因麻风病病原体麻风杆菌（3）染色特点：Z-N粉红色，抗酸性，吡啶可提取，过碘酸染色可恢复形态特点： 多形性杆 断裂 串珠 颗粒 簇集性形成球团（束） 菌球 形态与活力相关（图）

6、麻风病病原体麻风杆菌（4）ML的生物学特征世代时间：长，平均11-13天(鼠足垫) Mtb 20h最适生长温度：30 36最小感染量：3 40条活菌活力与致病性：4保存组织匀浆7-10天活力不变； 致病力与种族、地理环境无关； 高平顶株与低平顶株比免疫原性强麻风病病原体麻风杆菌（5）ML对物理因素的抵抗力平皿中 32.5 湿度78% 活28天 32.0 湿度32% 活14天土壤中（室温） 活43天0.5N NaOH (20) 活力不变10%二甲基亚砜(DMSO) (4) 保护剂作用紫外线照射(2+新神经功能损伤皮肤或神经活检中出现复发证据眼出现（瘤型）麻风活跃后来亦有把定义简化为： 皮肤切刮液

7、涂片出现ML或一个新皮损涂片有含完整菌的高BI，有组织学上证据，新损害中ML可在鼠足垫生长复发的定义及其演变Boerrigter等：一个新皮损出现或原皮损增大，有临床和组织学证据Paudian等：（7个标准）皮损扩大，浸润，红斑，产生新皮损，神经痛和肿大，新的肌肉麻痹，BI阳性第6届WHO专家组会议同意上述标准(1988)，提出：MB复发临床上容易识别，但在完成治疗后产生的PB复发与逆向反应很难鉴别麻风复发复发的定义及其演变近来复发的定义DDS单疗复发定义 病人疾病在痊愈后疾病再现MDT复发定义（WHO，1988） 病人在完成MDT规定疗程，在监测或监测时段后又发生新麻风症候和症状者谓MDT复

8、发。麻风复发复发的定义及其演变复发原因耐药 DDS单疗即使很好完成，复发者达50%(MB)持久菌 即使MDT，亦有10%的MB存在持久菌。其它原因 麻风复发复发原因耐药耐药菌株的定义 在抗感染的化学治疗过程中，由于致病微生物对药物产生耐受性，敏感性减弱以至丧失，造成疗效降低或丧失，甚至病情恶化，这种现象谓之耐药性（或称抗药性）。这种具有耐药性的细菌则称为耐药菌株。耐药菌株的实验室检查MI 接受有效抗麻风药物治疗的瘤型麻风病人6-9个月期间MI不下降到5%以下，或开始下降后又上升者，疑为可能耐药。BI 经3-5年有效(规律地)DDS治疗的LL和BL病人BI下降不明显或有上升趋势，或开始下降后又上

9、升者，疑为可能耐药。病理变化 若经一定期间的DDS治疗病理上浸润未见好转，甚或出现组织样麻风瘤图像者，应考虑耐药的可能复发原因耐药复发原因耐药耐药菌株的实验室检查结合临床证实长期正规足量DDS治疗，病情持续恶化者长期正规足量DDS治疗，病情好转但以后停顿不前，有的还出现恶化，但改用其它抗麻风药物治疗后临床改善，BI又重新下降者不规则小剂量治疗或开始用小剂量治疗后用小剂量维持，临床无改善或恶化已达临床标准，复发后用DDS再治无效有组织样麻风瘤损害（histoid leproma）对上述病例可进行“核实治疗”：在严密管理与观察下，每日口服100mg DDS或肌射二乙酰氨苯砜（DADDS），每周注射

10、300-400mg，正规治疗6个月，MI、BI、病理均不见效，临床亦无进步或恶化者，可定为临床耐药。复发原因耐药耐药菌株的实验室证实 鼠足垫接种证实是较可靠办法，一般观察6-12个月，连续给药 敏感低度耐药中度耐药高度耐药对照组细菌生长+细菌生长+细菌生长+细菌生长+试验组0.0001%细菌不生长细菌生长+细菌生长+细菌生长+0.001%细菌不生长细菌不生长细菌生长+细菌生长+0.01%细菌不生长细菌不生长细菌不生长细菌生长+复发原因耐药耐药的原因 小剂量和不规则治疗 病人吸收药物不佳 交叉耐药(与长效磺胺)耐药的危害 治疗困难；耐药菌株流行耐药药物 DDS治疗6年后 DPT治疗后2-3年 D

11、63、RF都发现了耐药菌株复发原因耐药耐药的防止方法 规则足量治疗 联合化疗复发原因持久菌持久菌 即使MDT，亦有10%的MB存在持久菌 持久菌存在的地方： 皮肤神经（Dharmendra,1973） 平滑肌（Harman,1965） 淋巴结（Kauretal,1975） 虹膜（Hashizuma et al,1965） 骨髓和肝脏（Karal et al,1972）治疗不足治疗依从性差仅DDS单疗治MBPB单用RF治疗PB有多个皮损和N受累免疫力下降再感染麻风复发复发原因其它原因麻风复发耐药菌与持久菌的区别复发原因耐药菌持久菌（残留活菌）是一种选择过程，即有效药物杀灭了敏感菌株，事先存在不敏

12、感株被留下来，取代了药敏株是一种适应过程，即在不利环境下，细胞代谢减缓到最低程度，使对药物不敏感的一种休眠状态细胞一般发生了改变（基因突变），耐药性因之遗传细胞本身未有改变，仅代谢上改变。能恢复正常菌的习性，不遗传。治疗失败常见于不适当的抗菌治疗，耐药后同样药治疗无论持续多久通常无效治疗失败，在停止治疗后重复用同药恢复治疗几乎总是奏效1995年WHO报告DDS 1940s发现，单疗10年后复发率30%，30年累积复发危险达40%，3%/人年MDT 10年后，观察20 000 MB（复发率0.77%), 50 000 PB（复发率1.07%） 危险率比DDS单疗低10倍麻风复发复发的危险性复发潜

13、伏期DDS单疗 55%57% PB 3年 BB 5年内 MB 6年内MDT 55%57% PB 3年 MB 平均9年麻风复发亦有报告复发50%产生在MDT停后头三年,75%在6年内。 PB50%产生在MDT后2年半内，75%在5年内。且复发危险不是与时俱进的，即若一个病人在5-6年内不复发，以后复发可能性很小。MDT后复发危险性低，且大多产生在5-6年内，故监测意义不大，可以宣布病人“治愈”了。MDT预防复发效果比DDS高90%，可以说，10年可以减少复发达1/2百万。（以上是WHO1995年结论）麻风复发复发潜伏期联合化疗复发的诊断标准少菌型麻风 在完成WHO少菌型联合化疗方案治疗6个月后，

14、在监测期或其后原损害再活动或加剧，或又发生新的麻风症状和体征。已达临床治疗标准后又发生新的活动性皮损，或虽未达临床治愈标准，但损害加剧或其病情趋向静止后原有皮损再活动，如浸润加剧和皮损扩大皮肤涂片查菌持续阴转后，在监测期或其后又重现抗酸杆菌，且任何部位细菌密度2+者；或在监测期或其后皮肤查菌虽未阴转，但连贯次皮肤涂片检查，任何部位细菌密度较前增加2+或2+以上，或有完整染色菌者皮肤活检的组织病理学检查抗酸染色阴转和肉芽肿完全消退后，又重现活动性麻风特异性病理改变 ，抗酸染色细菌密度在2+或2+以上，且有完整染色菌者鼠足垫接种证实有活菌者多菌型麻风 在完成WHO多菌型联合化疗方案治疗2年后，又出

15、现下列情况之一者联合化疗复发的诊断标准麻风复发的监测与检测监视新合成蛋白的免疫反应 氨基酸序列不同监视血清抗体水平 现有方法：PGL1-ELISA或35KD-ELISA 我们用ND-ELISA监视白细胞介素水平 麻风患者的细胞因子模式麻风复发的免疫学诊断方面ML计数法评估菌的荷量：BIML活力的测定：活菌引起复发，死菌抗原成分引起免疫体内法： 鼠足垫接种（正常鼠、免疫抑制鼠）体外法：1）细菌指数（MI） 2）荧光二乙酸溴乙锭染色法（FDA） 3）激光微探针质量分析（LAMMA） 4） ATP测定 5） M试验 6）其它体外试验麻风复发的监测与检测麻风复发的微生物学诊断()传统法DNA靶探针 敏

16、感度为104105RNA靶探针 比DNA稳定性差PCR 敏感性达1-10条菌，在PB，6075%阳性 但死菌也可阳性RT-PCR 80%PB复发和25%RR试验阳性麻风复发的监测与检测麻风复发的微生物学诊断()分子生物学法小 结问题的提出治愈后复发的疑问（三个“R”）是菌没有真正杀死，抑或是什么药物浓度达不到的地方，停药后再燃(reactivition)?是菌已被杀死，疾病痊愈，但死菌中的抗原惹起迟发超敏反应，抑或逆向反应(reversal reaction)?是病人又获同一菌株，抑或不同菌株的再感染(re-infection)?炎症和迟发超敏反应（DHR）炎症（inflammation） 表

17、现为疾病活动性，系疾病的天然（自然）过程。在此过程免疫（宿主与寄生物相互关系）未发生变动。变态反应（DHR） 表现为逆向反应，系疾病一种恶化，过程加速，病情加重。免疫在反应时发生变化或病情迅速恶化或发生病型的改变。再燃（复发）与反应 已愈疾病（治愈、静止状态）尔后再燃，病理学表现为正常的活动性炎症过程。虽然反应与复发发病机制完全不同，但在BT、TT很难区别。解决问题的草案联用BI(MI)、ND-ELISA、PCR麻风（含复发）的监测、预测： ND-ELISABI(MI) PCR+RT-PCR+麻风确诊：临床症状出现 BI(MI) PCR+按规定方案治疗麻风鉴别： 反应？BI(MI)- PCR-

18、 反应(RR) 按反应治疗 反应？BI(MI)+ PCR+ 反应(RR)+复发 按反应及复发同时治疗 治愈后临床症状出现 BI(MI)+ PCR+ 已诊断为麻风复发PCR耐药+ 耐药ML致复发 已诊断为麻风复发PCR不耐药 持久菌致复发 不明病例BI(MI)+PCR+RT-PCR+药敏试验(+)(-)(+)(-)同基因型(复发)不同基因(再感染)*敏感:按规定方案治疗不敏感:个体化方案治疗展望与推荐正确理解麻风基本控制和消灭基本控制 在现阶段将患病率、发病率控制在较低的水平消灭 微生物完全消灭，传播完全中止 达标后,ML依然存在,新病人仍出现,传播未中止,据现有技术不能预见麻风消灭. (32个国家