立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能

1、立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能 中国组织工程研究 第20卷 第10期 20160304出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 4, 2016 Vol.20, No.10 www. CRTER.org 研究原著 刁新峰，程立敏，薛 咏，胡成旺，蔡中立(南阳医学高等专科学校第一附属医院，神经外科，神经内科，胸外科，河南省南阳市 473000) 1 2 1 1 3 1 2 3 组织工程研究，2016，20(10):1446-1451. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016

2、.10.011 ORCID: 0000-0002-2828-950X(刁新峰) 文章快速阅读： 文题释义： 神经干细胞的治疗作用：细胞替代：补充缺失神经元和胶质细胞，促进神经环路重建。递质补充：分泌多巴胺递质。营养支持：分泌多种神经营养因子，改善局部微环境并启动再生相关基因的表达，完成神经修复。细胞动员：脑室室管膜下区细胞、海马结构部位内源性干细胞增生。结构整合：整合到宿主移植部位，实现真正神经再生。 立体定向技术：在立体定向仪的引导下，将特制的射频电极、干细胞针等手术器械准确送到颅内的特定部位或靶点，成为治疗疾病或诊断疾病的一种方式。现代立体定向技术是在传统立体定向技术的基础上，借助于先进的

3、CT、MRI图像融合技术和立体定向图谱匹配系统进行定位治疗的一种崭新的技术，使治疗更安全更有效。 摘要 背景：细胞替代治疗是重建受损神经系统组织结构，恢复神经系统功能的一种有效策略，具有极为广阔的应用前景。 目的：探讨立体定向脑内移植神经干细胞对颅脑损伤大鼠神经运动功能的影响。 方法：将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组，每组10只，应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，伤后1 d研究组大鼠脑实质内移植胚胎神经干细胞，对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。在脑损伤前1 d、伤后1 d、1周、2周运用神经学缺损评分法评价大鼠运动神经功能。移植后2周，取脑组织分别行苏木精-伊红染色、抗Brd

4、U、胶质纤维酸性蛋白、微管蛋白和酪氨酸羟化酶免疫组化染色。 结果与结论：伤后1，2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P 0.05)。研究组大鼠受损脑组织中有较多的BrdU阳性神经干细胞，一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白、微管蛋白和酪氨酸羟化酶阳性表达，对照组大鼠受损脑组织中未见有BrdU阳性细胞。实验结果表明，立体定向脑内移植神经干细胞可以在颅脑损伤灶中增殖分化，进而显著改善大鼠的神经运动功能。 关键词： 干细胞；移植；神经干细胞；立体定向脑内移植；颅脑损伤；增殖；分化 主题词： 神经干细胞；颅脑损伤；细胞增殖；细胞分化；组织工程 1446 P.O. Box 10002, Shenya

5、ng 刁新峰，男，1981年生，河南省省邓州市人，汉族，2004年郑州大学毕业，主治医师，主要从事神经外科疾病的研究与治疗。 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)10-01446-06 稿件接受：2016-02-04 http:/WWW. www.CRTER.org 110180 Diao Xin-feng, Attending physician, Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473000, H

6、enan Province, China www. CRTER.org Stereotactic transplantation of neural stem cells into the brain improves motor function of craniocerebral trauma rats Diao Xin-feng1, Cheng Li-min2, Xue Yong1, Hu Cheng-wang1, Cai Zhong-li3 (1Department of Neurosurgery, 2 Department of Neurology, 3Department of T

7、horacic Surgery, First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473000, Henan Province, China) Abstract BACKGROUND: Cell replacement therapy as an effective strategy for reconstruction of the central nervous system has very broad application prospects. OBJECTIVE: To investigate the ef

8、fect of stereotactic transplantation of neural stem cells into the brain on the neuromotor function of craniocerebral trauma rats. METHODS: Twenty male Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into study and control groups. Animal models of craniocerebral trauma were made using the improved

9、free-fall method in the rats. Then, model rats in the study and control groups were given parenchymal transplantation of embryonic neural stem cells and the same volume of culture medium with no stem cells at 1 day after injury, respectively. Neuromotor function of rats was assessed based on the neu

10、rological severity scores. At 2 weeks after transplantation, brain tissues were taken for hematoxylin-eosin staining, anti-BrdU, glial fibrillary acidic protein, -tubulin III and tyrosine hydroxylase immunohistochemistry staining. RESULTS AND CONCLUSION: The neurological severity scores in the study

11、 group were significantly lower than those in the control group at 1 and 2 weeks after injury (P 0.05). In the study group, there were many BrdU-positive neural stem cells in the brain tissues, some of which were positive for glial fibrillary acidic protein, -tubulin III and tyrosine hydroxylase; wh

12、ile in the control group, there was no BrdU-positive cell in the brain tissues. Experimental findings show that neural stem cells stereotactically transplanted into the brain can proliferate and differentiate in the brain lesion, and thereby notably improve the neuromotor function of rats with crani

13、ocerebral trauma. Subject headings: Neural Stem Cells; Craniocerebral Trauma; Cell Proliferation; Cell Differentiation; Tissue Engineering Cite this article: Diao XF, Cheng LM, Xue Y, Hu CW, Cai ZL. Stereotactic transplantation of neural stem cells into the brain improves motor function of craniocer

14、ebral trauma rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(10):1446-1451. 0 引言 Introduction 当前颅脑损伤已经成为威胁人类健康的重大疾病，由于神经细胞的不可再生性而使疾病对人体的损害不可逆转。传统的治疗方法也往往无法获得理想的效果。随着干细胞技术的不断发展，人们开始通过干细胞移植方式治疗疾病。干细胞具有很强的多向分化能力，可以在一定条件下发生定向分化。1992 年，学者Reynolds与Weiss通过研究发现，在成年中枢神经系统的室管膜下以及胚胎中存在一群特殊的细胞，这种细胞具有一定的自我增殖能力和干细

15、胞特性，并提出了“神经干细胞”这一概念。神经干细胞属于一种多能干细胞，来源于中枢神经系统，具有自我更新能力，在特定条件诱导下，能够分化为神经胶质细胞或特定类型神经元，参与修复神经损伤。神经干细胞在胚胎时期的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位，如脑室、脑室下区、中脑导水管周围。侧脑室附近的室管膜下区和海马是哺乳动物神经系统中神经干细胞最为集中的部位，近年的研究发现，位于室管膜前下区的神经干细胞具有特殊的迁移分化特 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 性。首先，室管膜前下区神经干细胞是出生后嗅球中间神经元终身更新的来源，室管膜前下区神经干细胞产生后，沿

16、着一条高度局限的迁移通道嘴侧迁移流以首尾相连的链式模式朝嗅球迁移，到达嗅球中央后，朝周边的颗粒细胞层和球周细胞层迁移而到达迁移终点，分化形成颗粒细胞和球周细胞，大约30%的球周细胞属于-氨基丁酸能神经元，70%的球周细胞属于多巴胺能神经元，它们是中枢神经系统中最大的多巴胺能神经元细胞群之一。近年来，脑实质内干细胞移植疗法已经成为一种新策略。但是，关于神经干细胞移植后在颅脑损伤局部的增殖和分化情况尚不清楚。为此，实验制备重型颅脑损伤大鼠模型，并向脑损伤部位注射神经干细胞，观察移植后大鼠神经功能恢复以及脑组织中神经元数量变化，以了解神经干细胞在损伤灶中的增殖和分化情况。 1 1 材料和方法 Mat

17、erials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。 1447 CRTER.org 1.2 时间及地点 实验于2015年4至7月在南阳医学高等专科学校第一附属医院完成。 1.3 材料 孕14-16 d SD大鼠3只，3个月龄雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，平均体质量为(22525) g，抓力下降，评定为2分；大鼠能够在各方向自主运动，但是提尾时向左侧旋转，评定为3分；大鼠自发性向左侧旋转，评定为4分。大鼠运动神经功能评分越高，表示运动神经功能恢复越差。 5 均由同济医学院动物中心提供。将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组，每组10只。研究组大鼠颅脑损伤后进

18、行神经干细胞脑实质内移植治疗，对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。 1.4 实验方法 1.4.1 颅脑损伤模型制作 应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠 (40 mg/kg)麻醉，将其固定在立体定向仪上，常规消毒铺巾，沿中线矢状切开头皮，剥离骨膜，显露右侧颅骨，用牙科钻在冠状缝和人字缝之间钻一直径5 mm骨窗，保持硬膜完整，使用自由落体装置将50 g打击锤从 40 cm高度自由落下撞击硬脑膜。撞击后大鼠出现四肢抽搐，呼吸暂停数秒钟，说明致伤成功。术后用双氧水及生理盐水清洗创口，止血、缝合头皮，动物清醒后分笼喂养2 。 1.4.2 胚胎神经干细胞培养 孕鼠静脉注射5

19、0 mg/kg BrdU标记神经干细胞。腹腔注射10%水合氯醛 (3.2 mL/kg)麻醉后将其处死，取出胎鼠大脑，解剖显微镜下仔细分离出皮质组织及海马组织，采用机械吹打结合胰蛋白酶消化的方法获得单细胞悬液，800 r/min离心5 min，弃去上清液，加入神经干细胞培养液，吹打均匀成单细胞悬液。将5105 个细胞接种到培养瓶中，置于37 、体积分数为5%CO2培养箱中悬浮培养。观察约50%神经球大小在100 m以上时进行传代，每5-7 d机械分离克隆传代1次。严格依据细胞生长速度及培养液pH变化每3-5 d半量换液1次。免疫细胞化学法鉴定BrdU标记的神经干细胞，免疫荧光染色检测神经干细胞巢

20、蛋白的表达3 。 1.4.3 脑实质内移植 伤后1 d再次对大鼠进行麻醉，打开原先骨窗，立体定向注射神经干细胞悬液。研究组大鼠损伤脑组织内注射6 L神经干细胞悬液，于骨窗边缘分3点注入，每点2 L，深度达硬膜下3.0 mm，留针5 min，缓慢退针，缝合头皮。对照组同法注射等量的不含干细胞的培养液4 。 1.4.4 神经功能评估 在脑损伤前1 d、伤后1 d、1周、2周运用神经学缺损评分法评价大鼠运动神经功能，评分标准：大鼠无显著的神经功能缺失，评定为0分；大鼠对侧前肢屈曲，评定为1分；大鼠在提尾时对侧前肢 1448 1.4.5 免疫组化染色 移植后2周，处死大鼠取其脑组织，进行常规石蜡切片，

21、分别行苏木精-伊红染色、抗BrdU、胶质纤维酸性蛋白、微管蛋白和酪氨酸羟化酶免疫组化染色6 。 1.5 主要观察指标 大鼠运动神经功能评分。神经干细胞移植后脑内损伤灶的胶质纤维酸性蛋白、 BrdU、微管蛋白和酪氨酸羟化酶的表达。 1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计分析所有数据，计量资料用x_ s表示，两两比较予以t 检验，P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 神经干细胞的形态 原代细胞均为小圆形细胞，接种后6 d可见大多数细胞死亡，少数残余细胞分裂增殖为球形细胞团，称为神经球。原代培养10 d后，将神经球机械分离重新制作出单细胞悬液并进行传代，7- 1

22、0 d后形成次代神经球。免疫荧光方法检测神经球巢蛋 白阳性表达(图1A)，同时可见BrdU阳性细胞(图1B)。 2.2 实验动物数量分析 入组20只SD大鼠均进入最终的结果分析，未出现中途脱落或者死亡。 2.3 两组大鼠不同时间运动神经功能恢复程度 两组大鼠伤后1 d、1周、2周的神经学缺损评分均显著高于伤前1 d(P 0.05)，伤后1，2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P 0.05)，见表1。 2.4 神经干细胞移植后的成活及分化情况 研究组大鼠受损脑组织中移植BrdU标记的神经干细胞，抗BrdU免疫组化染色显示，移植损伤灶中心区域有最多的BrdU阳性干细胞，在损伤灶的远隔部

23、位也有较多的BrdU阳性细胞，细胞为圆形，大小中等，呈棕褐色(图2A)，可见移植到损伤灶的一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达(图2B)；对照组大鼠受损脑组织中未见有BrdU阳性细胞。脑组织切片苏木精-伊红染色显示，研究组大鼠移植部位有典型的神经细胞样形态学改变(图2C)。经免疫细胞化学染色观察发现，微管蛋白和酪氨酸羟化酶免疫反应均呈阳性，提示细胞分化为神经元以及少突胶质细胞(图2D，E)。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org CRTER .org 表1 两组大鼠不同时间神经学缺损评分比较(xs，n=10，分) Table 1 Compa

24、rison of neurological severity scores of the two groups at different time 组别 对照组 研究组 伤前1 d 0 0 伤后1 d 3.451.21a 3.551.10a 伤后1周 2.901.51a 2.021.16ab 伤后2周 2.721.16a 1.460.65ab _ 图1 免疫荧光法检测神经球表面巢蛋白和BrdU的表达(100) 表注：与同组伤前1 d比较，aP 0.05；与对照组比较，bP 0.05。 Figure 1 The expression of nestin and BrdU on the neura

25、l cell surface detected by immunofluorescence assay (100) A C 图注：图中A显示巢蛋白阳性表达；B显示BrdU阳性表达。 图2 神经干细胞移植后的成活及分化情况 Figure 2 The survival and differentiation of transplanted neural stem cells 图注：图中A可见研究组大鼠脑组织中可见BrdU阳性神经干细胞(400)；B可见研究组大鼠脑内损伤灶有胶质纤维酸性蛋白和BrdU 阳性细胞(200)；C可见研究组大鼠脑组织中移植的细胞呈现出典型的神经元样形态学改变(苏木精-伊红

26、染色，100)；D，E分别为免 疫细胞化学染色微管蛋白和酪氨酸羟化酶免疫反应均呈阳性。 3 讨论 Discussion 神经干细胞具有多项分化潜能，能够向神经系统大部分类型细胞分化，并长期自我更新，维持稳定的神经细胞数量，保持未分化或低分化的特性 7-10 分化填补缺损区。神经干细胞能够分泌大量的营养物质，显著减少神经细胞凋亡，提供适宜的微环境，能够促进机体损伤神经功能的修复。实验结果表明，在体外环境下培养胚胎神经干细胞，利用立体定向移植方式将神经干细胞悬液注射至脑损伤大鼠病灶内，可以显著改善大鼠脑损伤。研究还发现，大鼠脑组织切片中神经元数量显著增加，经BrdU免疫组化检测观察到移植的神经干细

27、胞在大鼠颅内损伤区发生了存活和分化、迁移。依据移植部位，脑实质内移植又可以分为损伤中心移植和损伤边缘移植等其他类型。脑实质内移植的优越性：移植细胞直接进入脑实质内，血脑屏障等因素不会对其造成直接而深刻的影响 34-38 。神经干细 胞的增殖方式包括不对称分裂和对称分裂，对称性分裂是指由一个神经干细胞经过一次分裂产生两个完全相同的子代神经干细胞，主要发生于胚胎神经管形成期神经干细胞数量急剧增加时；非对称性分裂是指一个神经干细胞经过一次分裂产生两个不同的子代细胞，一个神经干细胞和一个神经前体细胞，后者在外界刺激因子的作用下最终向多个细胞系的终末期分化，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等 11

28、-18 。具有多种分化潜。实验向研究组大鼠受损脑 能是神经干细胞的一个基本属性，在体外培养体系中，神经干细胞的分化类型包括两种形式，一种形式为神经干细胞的诱导分化，另一种形式为神经干细胞的自然分化 19-25 组织移植大鼠神经干细胞，发现有标记的神经干细胞存在于大鼠脑组织损伤灶中。抗BrdU免疫组化染色表明，移植损伤灶中心区域BrdU阳性细胞最多，同时损伤灶的远隔部位也有较多的BrdU阳性细胞，细胞为圆形、呈棕褐色，同时可见损伤灶一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性；对照组大鼠没有BrdU阳性细胞，从这里可以看出，神经干细胞移植后能够发生一定的迁移。 大脑内神经组织中包含多种细胞类型，例如星形胶质

29、细胞和神经元细胞等。大脑功能依赖于神经元并通过各种神经信号传导来实现。脑内神经元可发挥出不同的功能，例如胆碱能神经元和多巴胺能神经元以及5-羟色 1449 。 近年来，细胞替代治疗中枢神经系统损伤或病变已经发展成为治疗神经系统疾病的策略，具有极为广阔的应用前景。细胞移植修复受损脑组织是一种有效的治疗方法。在移植部位，神经干细胞分裂增殖，在局部微环境作用下，神经干细胞分化为相应的细胞，进而替代受损细胞，从而有效恢复中枢神经系统功能。神经干细胞移植修复神经功能的可能机制 26-33 ：向神经细胞直接 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH CRTER.o

30、rg 胺能神经元等，与多种神经中枢疾病之间存在十分密切的联系。神经发生持续于整个生命过程，对认知功能、脑损伤修复等起到重要作用。神经干细胞则可以在一定的情况下发生分化，形成不同的神经元。其中，微管蛋白是广泛分布的一类球状蛋白质，是细胞内微管的基本结构单位，在细胞的运动和分裂中都发挥着重要作用 30 行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。 作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。 。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署实验选择微管蛋白和酪氨酸羟化酶免疫荧光染色，研究

31、组神经干细胞分化为神经元(微管蛋白染色阳性)和多巴胺神经元(酪氨酸羟化酶染色阳性)。上述结果表明，大鼠胚胎脑组织神经干细胞可以分化为神经元以及少突胶质细胞。同时，研究组大鼠的损伤灶脑组织BrdU阳性细胞数显著多于对照组；组内比较，两组大鼠伤后1 d、1周、2周的神经学缺损评分均显著高于伤前1 d(P 0.05)，但伤后1，2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P 0.05)，说明神经干细胞移植后大鼠神经功能恢复显著优于对照组。实验结果表明，立体定向脑内移植神经干细胞在大鼠脑损伤灶中会增殖分化，进而显著改善大鼠的神经运动功能。 神经干细胞移植主要存在以下问题：神经干细胞的定向诱导分化。

32、干细胞具有不同的来源及分化程度，最终会对治疗效果造成极大程度的影响。神经干细胞有效的生长控制，体内环境等很多因素均直接影响着神经干细胞生长，致瘤性会在无限制生长的情况下发生，而坏死凋亡则会在生长停滞的情况下发生。将神经干细胞和宿主细胞的功能有效发挥出来，采取相关措施对相关影响因素进行有效控制仍然需要进一步深入研究，如物种、内环境变化等 39-40 。 作者贡献：实验设计为第一、二作者，实验实施为第一、三作者，实验评估为第一、四作者，资料收集为第一、五作者。 利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。 伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethical issues in

33、 animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。 文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同 1450 了版权相关协议。 4 参考文献 References 1 高伟东,李晓冬.胚胎神经干细胞对脑损伤治疗作用的实 验研究J.解剖学研究,2010,32(1):39-42. 2 韩志桐,苏宁,吴日乐,等.GFP 转基因小鼠神经干细胞移 植治疗大鼠帕金森病的实验研究J.临床神经外科杂志, 2012,9(3):139-142. 3 杨忠旭,张颖,历俊华,等.神经干细胞移植治疗颞叶癫痫的 近期效果研究J.中国

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