东南大学生化王大勇第八章

1、Chapter 8: General introduction to Enzyme/酶本章内容酶催化作用的特点酶的化学组成及其特点酶的分类和命名酶的专一性酶的活力测定和分离纯化核酶抗体酶酶工程简介没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。我国人民在八千年以前就开始利用酶，夏禹时代，人们就会酿酒。虽然我们祖先并不知道酶是何物，也无法了解其性质，但根据生产和生活的积累，已把酶利用到相当广泛的程度。1810年Jaseph Gaylussac发现酵母可将糖转化为酒精。1857年微生物学家Pasteur等人提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果，他认为只有获得酵母细胞才能进行发酵。Liebig反对这种观点。直到1

2、897年，Bchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Bchner获得了1911年诺贝尔化学奖。1833年Payen和Persoz第一次分离出酶。1878年Khne才给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思是“在酵母中”。1894年Fisher提出了“锁与钥匙”学说。1903年Henri提出了酶与底物作用的中间复合物学说。1913年Michaelis和Menten导出了米氏方程。1926年Sumner从刀豆中提到了脲酶，并获结晶。1936年Northrop和 Kunitz得

3、到了胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶结晶，并证明是蛋白质。为此，Sumner和Northrop获1949年诺贝尔奖。80年代初Cech与Altman分别发现了具有催化功能的RNA核酶（ribozyme）.近十年来酶学研究得到很大发展，表现在：1.基础研究. 2.酶的应用。Section 1: 酶催化作用的特点(一)酶和一般催化剂的比较1.用量少而催化率高。2.它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。酶本身在反应前后也不发生变化。3.酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。催化剂参与反应是降低了反应的活化能。H2O2分解： 没有催化剂时，需活化能75.4k

4、J/mol； 液态鈀作催化剂，48.9 kJ/mol； 过氧化氢酶催化，8.4 kJ/mol。Enzymes lower the activation energyThe difference between the energy levels of the ground state/基态 and the transition state/过渡态 is the activation energy, G.G: overall free energy change in the reaction（二）酶作为生物催化剂的特点 1.酶易失活 2.酶具有很高的催化效率高 3.酶具有高度专一性 4.酶活性

5、受到调节和控制酶的转换数（turnovcr number,TN, kcat）：在一定条件下，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。 酶转换数（kcat）/s-1碳酸酐酶3-酮类固醇异构酶乙酰胆碱酯酶青霉素酶乳酸脱氢酶胰凝乳蛋白酶DNA聚合酶I色氨酸合成酶600 000280 000 25 000 2 000 1 000 100 15 2一些酶的最大转换数酶具有高度专一性：酶对催化的底物有高度的选择性 氢离子:催化淀粉、脂肪和蛋白质的水解。淀粉酶，酯酶，蛋白酶酶活性受到调节和控制：（1）调节酶的浓度（2）通过激素调节酶活性（3）反馈抑制调节酶活性（4）抑制剂

6、和激活剂对酶活性的调节 （5）其他调节方式通过别构调控、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶活性。（1）调节酶的浓度一是诱导或抑制酶的合成；二是调节酶的降解。例如乳糖操纵子可以合成-半乳糖苷酶、半乳糖苷通透酶和硫半乳糖苷转乙酰酶，它们可以受乳糖或诱导物异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）的诱导而促进合成。乳糖或IPTG可以与原来存在于该系统的阻遏物结合，使阻遏物和DNA的结合能力降低约1 000倍，解除抑制，使3种酶的合成加快，酶浓度提高。大肠杆菌有一种所谓的葡萄糖效应，就是当有葡萄糖存在下，不利用乳糖，表明葡萄糖抑制上述3个酶的合成。（2）通过激素调节酶活性有些酶的专一性是由激素调控

7、的，例：哺乳动物乳腺组织中合成乳糖是由乳糖合成酶催化的，该酶由两个亚基即催化亚基和调节亚基组成。催化亚基单独存在时不能催化合成乳糖，但能催化半乳糖以共价键的方式连接到蛋白质上形成糖蛋白。调节亚基实际上就是乳汁中的a-乳清蛋白，其本身无催化活性，但当与催化亚基结合后，就可以改变催化基的专一性，催化半乳糖和葡萄糖反应生成乳糖：调节亚基合成是受激素控制的。激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。（3）反馈抑制调节酶活性许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质生成的第1步的酶，往往被它们终端产物抑制。这种抑制叫反馈抑制。例如由苏氨酸生物合成为异亮氨酸，

8、要经过5步，反应第1步由苏氨酸脱氨酶催化，当终产物异亮氨酸浓度达到足够水平时，该酶就被抑制，异亮氨酸结合到酶的一个调节部位上，通过可逆的别构作用对酶产生抑制。当异亮氨酸的浓度下降到一定程度，苏氨酸脱氨酶又重新表现活性，从而又重新合成异亮氨酸。（4）抑制剂和激活剂对酶活性的调节酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响酶的活性。例如大分子物质胰蛋白酶抑制剂，可以抑制胰蛋白酶的活性。小分子的抑制剂如一些反应产物，像1，3-二磷酸甘油酸变位酶的活性受到它的产物2，3-二磷酸甘油酸的抑制，从而对这一反应进行调节。Section 2: 酶的化学本质及其组成Chemical essence of bioc

9、atalystAlmost all are proteins;Some are RNA/ribozymeSome are DNA （一）酶的化学本质 （二）酶的化学组成 （三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体（一）酶的化学本质证明酶的化学本质是蛋白质的主要依据是：1.酶经酸碱水解后的最终产物是氨基酸，酶能被蛋白酶水解而失活；2.酶是具有空间结构的生物大分子，凡使蛋白质变性的因素都可使酶变性失活；3.酶是两性电解质，在不同pH下呈现不同的离子状态，在电场中向某一电极泳动，各白具有特定的等电点；4.酶和蛋白质一样，具有不能通过半透膜等胶体性质；5.酶也有蛋白质所具有的化学呈色反应。Ribozyme1)

10、Enzyme2) Ribonucleic AcidNOT PROTEIN1989 Nobel PrizeIn ChemistrySid AltmanTom Cech（二）酶的化学组成单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质。结合蛋白酶：某些酶，例如氧化-还原酶等，其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分。结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶及金属离子(或辅因子cofactor)。酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。单纯的酶蛋白无催化功能。蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)辅助因子(cofactor) 金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)辅助因子分类（按其与

11、酶蛋白结合的紧密程度） 辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。 辅基 (prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体1.单体酶：由一条多肽链构成的酶。大多数的水解酶。2.寡聚酶：由两条及两条以上的多肽链构成的酶。如：糖代谢的酶。3.多酶体系：由几个功能上相关的酶嵌合而成的酶的络合物。丙酮酸脱氢酶系。4.多功能酶：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。Section :酶的命名和分类 （一）习惯命名法 （二）国际系统命名法 （三）国际系

12、统分类法及酶的编号 （四）六大类酶的特征和举例（一）习惯命名法（1）根据其催化底物来命名；如：淀粉酶。（2）根据所催化反应的性质来命名；如：转氨酶。（3）结合上述两个原则来命名，如：谷丙转氨酶。（4）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。如小牛小肠碱性磷酸酶。（二）国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应: 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸（三）国际系统分类法及酶的编号1.氧化还原酶类：催化氧化还原反应。2.转移酶类： 催化基团转移反应。 3.水解酶类： 催化水解反应。这是特

13、殊的一类转移酶，水作为转移基团的受体。4.裂解酶类： 催化非水解和非氧化的底物的消除反应，或裂解，生成一个双键。 5.异构酶类： 催化异构化反应。 6.连接酶类： 催化两个底物的连接反应或称之交联反应。 乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号（四）六大类酶的特征和举例 1.氧化还原酶类 2.转移酶类 3.水解酶类 4.裂解酶类 5.异构酶类 6.连接酶类1.氧化还原酶类氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如：乳酸(Lactat

14、e)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。2.转移酶类转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。3.水解酶类主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：4.裂解酶类主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶等。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应。例如， 苹果酸裂合酶即延胡索酸水合酶催化的反应。5.异构酶类异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。6.连接酶类合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、

15、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A + B + ATP + H-O-H = AB + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸Coenzyme/辅酶：bind loosely (non-covalent) to apoprotein, thus could be removed by dialysis.Prosthetic group/辅基：bind covalently to apoprotein cofactorsMetal ions：Fe2+、Fe3+ 、 Zn2+、 Cu+、Cu2+、 Mn2+、Mn3

16、+、Mg2+ 、Mo6+ 、Co2+etc.Organic molecules associated with vitamins ：NAD，NADP，FAD, biotin etc. Section :酶的专一性 （一）酶的专一性 （二）关于酶作用专一性的假说（一）酶的专一性 酶的专一性 又称为特异性，是指酶只能催化一种底物或一类结构相似的底物，酶对所催化底物严格的选择特性为酶的专一性。酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团、键）专一性绝对专一性光学异构专一性几何异构专一性基团、键专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。RCOO- +R OH + H+酯酶：RCOR + H2OOO

17、CH2OHOHOHOH15-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶：H2NCNH2 + H2OO2NH3 + CO2（二）关于酶作用专一性的假说 1.“三点结合”的催化理论 2.锁钥学说 3.诱导契合学说1.“三点结合”的催化理论认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。2.锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。3.诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导

18、才形成了互补形状.Induced-fit in hexokinaseHexokinase can discriminate between water and glucose because of an induced-fit only when glucose is the substrate.Section 5: 酶活力测定与分离纯化 （一）酶活力的测定 （二）酶的分离和纯化（一）酶活力的测定 1.酶活力 2.酶的活力单位 3.酶的比活力 4.酶活力的测定方法1.酶活力酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的速率来表示。反应速率越大，酶活力越

19、高，反之，酶活力越低。反应速率 单位时间内底物的减少量和产物的生成量。初速度 反应开始时，酶反应速度不变时的速度。2.酶的活力单位酶活力单位：一般用活力单位U(Unit)表示，许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成一微摩尔产物所需要的酶量为一个酶活力单位。 在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即： 1U=1mol/min 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s 1kat = 6107IU3.酶的比活力酶的比活力：是指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数，它是酶制剂纯度

20、的一个指标。 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）酶的收率：指纯化过程中酶活性的收率。产率%（回收率）= 100每次总活力第一次总活力纯化倍数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值。纯化倍数 = 每次比活力第一次比活力4.酶活力的测定方法（1）分光光度法 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。简便、迅速、准确。 （2）荧光法 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。（3）同位素测定法 （4）电化学法 有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。（二）酶的分离和纯化 1.选材 2.破碎 3.抽提 4.分离及纯化 5.结晶 6.保存1.选材

21、 选择酶含量丰富的新鲜生物材料，一种酶含量丰富的器官或组织往往和含量较低的器官或组织相差上千倍或上万倍。目前常用微生物为材料制备各种酶制剂。 酶的提取工作应在获得材料后立即开始，否则应在低温下保存，-20-70为宜。或将生物组织做成丙酮粉保存。2.破碎动物组织细胞较易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、高速组织捣碎机就可达到目的。微生物及植物细胞壁较厚，需要用超声波、细菌磨、冻融、溶菌酶或用某些化学溶剂如甲苯、去氧胆酸钠、去垢剂等处理加以破碎，制成组织匀浆。3.抽提在低温下，以水或低盐缓冲液，从组织匀浆中抽提酶，得到酶的粗提液。4.分离及纯化 酶是生物活性物质，在分离纯化时必须注意尽量减少酶活性损

22、失，操作条件要温和，全部操作一般在05间进行。 根据酶大多属于蛋白质这一特性，用一系列分离蛋白质的方法，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法可从酶粗提液中初步分离酶。然后再采用吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱法等层析技术或各种制备电泳技术进一步纯化酶，以得到纯的酶制品。为了得到比较理想的纯化结果，往往采用几种方法配合使用。5.结晶通过各种提纯方法获得较纯的酶溶液后，就可能将酶进行结晶。酶的结晶过程进行得很慢。如果要得到好的晶体也许需要数天或数星期。通常的方法是把盐假如一个比较浓的酶溶液中至微呈混浊为止。有时需要改变溶液的pH及温度，轻轻摩擦玻璃

23、壁等方法以便达到结晶的目的。6.保存（1）制成干粉保存 通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冰冻一干燥得到酶粉，低温下可较长日寸期保存。（2）浓盐溶液中保存 将酶溶液用饱和硫酸铵溶液反透析后在浓盐溶液中保存。（3）甘油低温保存 将酶溶液制成25%甘油或50%甘油分别贮于25、或50冰箱中保存。注意酶溶液浓度越低越易变性，因此切记不能保存酶的稀溶液。1) Enzyme2) Ribonucleic AcidNOT PROTEIN1989 Nobel PrizeIn ChemistrySid AltmanTom Cech Section 6: Ribozyme/核酶L19 rRNA,1982RNase

24、P, 1978Many chapters in our biochemistry textbooks have to be revised. Yale University University of Colorado In Clinical Trial.ANGIOZYME TMHEPTAZYME TMRibozyme designed to inhibit Vascular EndothelialGrowth Factor (VEGF).ANGIOGENESISRibozyme targets highly conserved sequences of theHepatitis C Viru

25、s.HCV DRUG RESISTANCESection :抗体酶（一）抗体酶（二）抗体酶的制备原理（三）抗体酶的应用（一）抗体酶 抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalytic antibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。 （二）抗体酶的制备原理 抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子向结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗

26、体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。 O C A. 酯酶的底物酯B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物磷酸酯类似物(半抗原)对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体免疫免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体（三）抗体酶的应用 催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。 目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基

27、本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。 充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。Section :酶工程简介 （一）化学酶工程 （二）生物酶工程将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzyme engineering)这样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。（一）化学酶工程 1.天然酶 2.固定化酶 3.化学修饰酶 4.人工模拟酶1.天然酶工业用酶制剂多属于通过微生物发酵而获得的粗酶，价格低，应用简单，产品种类少，使用范围窄。例如，洗涤剂、皮革生产等用的蛋白酶；纸张制造、棉布退浆等用的淀粉酶；漆生产用的多酚氧化酶；乳制品用的凝乳酶等。天然酶的分离纯化随着各种层析技术及电泳技术的发展，得到长足的进展，目前