细菌的耐药性及检测

1、细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如MRSA、 耐万古霍素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及0内酰胺酶中的超广谱B内酰胺酶 (ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属B内酰胺酶等。临床抗生素的选择使用非常困难。 因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测, 对患者选择个体化的治疗方案：同时通过耐药检测及流行病学调査，为医院感染控制方案制 订提供依拯：也有助于新药的抗菌特性研究。临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于 体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。药敏试

2、验中抗菌药物的选择原则抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依拯竹医院院内感染控制委员会、临床医 师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条 件：选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某 类菌株具有特定的意义等。有助于指导临床抗感染治疗和流行病学的调査。应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的 抗菌药物进行体外药敏试验等。根据细菌种类或来源，通常选择6-16种不同抗菌药物。选择方案在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组选择。结合 本院实际情况制定选用方案。肠

3、杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案首选试验和报告的抗菌药物：氨节西林、氨节西林/舒巴坦或阿奠西林/克拉维酸 或哌拉西林/他呼巴坦或替卡四林/克拉维酸中任一种：头泡卩坐林或头抱噬吩、头抱咲辛或 头抱孟多、头抱西丁或头抱替坦、头抱噬衍或头泡他咙或头抱曲松或头抱哌酮中任选二种: 头抱毗肠或头抱匹罗：庆大霉素：环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选12种；亚胺培 南，复方新诺明。次选试验和报告的抗菌药物：咲喃妥因、氯霊素、妥布霉素、卡那靈素、阿米卡星、 氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。从肠道标本中分离的沙门菌属和志贺菌属细菌常规只应试验和报告氨节西林、复方 新诺明及一种座诺酮类抗菌药

4、物:分离自肠道以外的沙门菌属菌株应试验和报告多种抗菌药 物的药敏试验和报告，包括氯霉素和三代头抱菌素。分离自脑脊液的肠杆菌科细菌，只需报告氨节西林、头抱噬吩、头砲哇咻、庆大霉 素的药敏结果。采用合适的方法如双纸片法等检测ESBLs：对产ES-BLs细菌，不管实际药敏检测结果 如何，所有青廉素类、头泡菌素类和氨曲南的试验结果报告耐药。铜绿假单胞菌和不动杆菌属等药敏试验抗菌药物选择方案首选试验和报告的抗菌药物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一种，头抱他咙、 头抱哌酮、头抱毗衍、氨曲南、亚胺培南或美洛培南；庆大鑼素、阿米卡星、妥布靈素：环 丙沙星等。次选试验和报告的抗菌药物：竣节西林、头抱噬肝或头

5、砲曲松、奈替米星、氯霊素、 四环素、左氧氛沙星或诺氟沙星或氧氟沙星、复方新诺明等。除铜绿假单胞菌和不动杆菌可用纸片扩散法进行药敏试验，对其他非发酵菌应使用 稀释法进行药敏试验。葡萄球菌属菌种药敏试验抗菌药物选择方案首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G、苯卩坐西林、头抱噬吩或头抱哇咻：红廉素或 克拉霍素或阿齐霉素、克林霉素：万古霉素：复方新诺明。次选试验和报告的抗菌药物：氯靈素、环丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星、庆大霉 素、四环素、利福平、咲哺妥因等。青篷素G敏感的匍萄球菌对其他青篷素类、头抱菌素药物敏感：青靈素G耐药，苯 卩坐西林敏感菌株，对B内酰胺酶不稳泄的青巒素类耐药，对B内酰胺酶稳定的青霉素

6、类、B 内醜胺酶抑制剂复合制剂及头抱菌素类抗菌药物敏感:苯哇西林耐药的葡萄球菌对所有B内 酰胺类抗菌药物耐药。因此只要从青霉素G及苯哇西林药敏试验结果，即可推断B内酰胺 类抗菌药物的敏感性，不必对这类抗菌药物进行常规药敏试验。腐生葡萄球菌对苯哇四林的耐药表现不稳左，不能进行以上推导，应以每种抗菌药 物稀释法实际检测结果判建。肠球菌属药敏试验抗菌药物选择方案首选试验和报告的抗菌药物：青雹素G或氨节四林、万古霉素。次选试验和报告的抗菌药物：庆大瑟素500、链霍素2000、氯需素、红霊素、四环 素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、咲喃妥因等。由于肠球菌天然对氨基糖昔类存在低度 耐药，因此在测左时必须使

7、用髙浓度药物测左，测定结果仅预示能否用常规剂量进行治疗。在体外检测肠球菌对头鞄菌素娄、氨基糖昔类(除高水平耐药筛选外)、克林霉素、复 方新诺明可出现敏感，但临床治疗无效，应报告耐药。不产B内酰胺酶、青霊素G敏感的肠球菌，可预示氨节四林、阿莫西林、氨节西林 /舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他哇巴坦敏感。来自血液、脑脊液的菌株应检 测B内酰胺酶。对严重肠球菌感染，如心内膜炎患者通常用青霊素或氨节西林或用万古霉素 加一种氨基糖昔类药物联合治疗。耐万古靈素肠球菌(VRE)可选用氯監素、红靈素、四环素、利福平等抗菌药物作药敏 试验，或和感染科医师、临床药学帅等共同商左，并将检测结果报告临床。除肺

8、炎链球菌外其他链球菌属菌药敏试验抗菌药物选择方案首选试验和报告的抗菌药物：青雹素G或氨节四林、红霉素、氯霉素、林可霉素、 万古霊素等。次选试验和报告的抗菌药物：头砲噬肪或头抱曲松、头抱毗府、左氧氟沙星、氧氟 沙星等。lflL液和正常无菌部位的体液分离到草绿色链球菌，应检测青霉素G的最低抑菌浓度 (Minimalinhibitoryconcentration, MIC)从尿道分离到的此类细菌，不做红霉素、氯霊素和克林霉素的常规药敏报告。不需常规进行对用于治疗A群、B群链球菌的青命素及苴他B内酰胺类抗菌药物的敏 感试验。发现万古霉素耐药或中介的A群、B群链球菌菌株，应送参考实验室予以确认。体外抗菌

9、药物敏感试验常用的检测方法目前可用于细菌药敏检测的方法较多,常用的有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、 E-test法和自动化仪器法等。根搦实验室条件和需要选用不同方法。稀释法有肉汤稀释法和琼脂稀释法。适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如 肠杆菌科、非发酵菌、匍萄球菌属和肠球菌属：嗜血杆菌属、奈瑟菌属、肺炎链球菌及其他 链球菌等菌株，还适用于厌氧菌、酵母样貞菌及支原体等。操作步骤如下：抗菌药物的稀释：根据每种药物、细菌种类和感染部位的不同，选择不同的抗生素 浓度稀释范国，用阳离子调节的M-H肉汤以2n进行倍比稀释抗菌药物(如256、128、64、 0.125)。将稀释后的药物加人试验管，

10、或加入冷却至4555CM-H琼脂培养基中，立即 按无菌要求倾注至无菌平皿。菌液配制：用无菌生理盐水或M-H肉汤配制成0.5麦氏单位浊度的菌悬液。接种：在配制好的含药浓度梯度肉汤管中加入上述菌悬液，使其终浓度为105cfu / ml：如果用琼脂稀释法则调节菌悬液为浊度104cfu/ml,采用点种方式接种。结果观察：最低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration.MIC)的判读:肉汤稀释法：抑制 细菌生长的最低药物浓度为MICo按受试菌的生长条件，将上述接种好的试验管或平板置 35C及适当的环境中培养1624小时后观察结果。肉眼观察无细菌生长试验管的最低药物 浓度，为该

11、抗菌药物的MIC。琼脂稀释法：无菌生长的含药平板的最低药物浓度为MIC。 一般比肉汤稀释法高1个稀释度。最低杀菌浓度(Minimalbactericidalconcentration.MBC)的判读:MBC表示抗菌药物 杀火99.9%或以上受试菌所需的最低浓度。将髙于MIC13个稀释度的培养液转种于相应 的平板上，在合适条件下35C培养1824小时，杀火99.9%或以上受试菌所需的最低浓度 为最低杀菌浓度(MBC)。结果报告：根据测立的MIC值，和相应抗生素的平均血药浓度或组织浓度比较。如 MIC值：血药浓度W23,则报告敏感：MIC值鼻血药浓度则报告耐药：两者之间为中介。纸片扩散法(K-B法

12、)适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如肠杆菌科细菌、非发 酵菌、筋萄球菌和肠球菌：进行改良后可用于苛养菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌 及其他链球菌等的检测。操作步骤如下：培养基:M-H琼脂培养基。厚度为4mm, pH7.27.4。(2)培养物制备:直接菌悬液法：取纯培养物直接悬浮于无菌盐水或M-H肉汤培养基， 调节悬液浊度至0.5麦氏单位(1.5X108cfu/mL)：肉汤增菌法:取纯培养物接种M-H肉汤， 35C培养46小时，使浊度达到0.5麦氏单位，可用无菌生理盐水或M-H肉汤调节。接种：用无菌棉签浸入上述菌悬液中，取岀时将多余的菌悬液在管壁上挤出，均匀 涂布整个平板表而，置室温

13、35分钟。贴药敏纸片：用无菌银子或分配器将根据要求选左的含药纸片贴于平板表而，使纸 片完全和培养基表而接触，每两个纸片间的中心距离不少于24mm3通常直径为90mm的平 板可贴47张纸片。置35C孵育1624小时。抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显菌苔生长的边缘为界，用最小量度为mm的 卡尺量取抑菌环直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可忽略不讣。复方新诺明抑菌环内 会有轻微细菌生长，小于20%左右可忽略不计。结果报告：根据每种细菌和每种药物之间的MIC和抑菌环直径之间的相关关系，抑 菌环直径的大小可以反应MIC值的髙低。因此根据抑菌环直径的大小可以参照稀释法MIC 值的判断标准报告敏感、耐药

14、和中介。每种细菌和每种药物之间判断标准范帼可以参考美国 CLSI解释标准。体外抗菌药物联合敏感试验通常单种细菌的感染用一种抗生素可以控制。但在以下 一些情况需要联合使用抗生素：严重感染(如急性心内膜炎、败血症、腹腔脓肿及脑脓肿等)： 病原菌不明确或单一药物疗效不佳：由多重耐药菌株引起的全身感染：中枢神经系统等感染 部位药物不易渗八：长期用药可能产生耐药性的感染疾病，如结核病和慢性计髓炎等；混合 感染。此时需要进行抗菌药物的联合敏感试验。抗菌药物联合试验的结果将岀现以下的结果：协同作用：表示两种药物药效可大T单 个药物使用的总和；累加作用：表示两种药物联合使用后药效等于两个药物各自单独使用 时的

15、总和：无关作用：表示两种药物联合使用的药效等于活性最大的药物的药效：拮抗 作用：表示两种药物联合使用的药效小于奠中活性最大的药物的药效。根据抗菌药物作用机制可分为杀菌剂和抑菌剂，按其作用的速度又可分为快效和慢效, 将不同作用机制的药物联合使用会产生不同的抗菌效果。杀菌剂之间联合使用可增强抗菌 作用或延迟耐药性出现，并可减少单一用药剂量，降低不良反应，是临床最常用的方法。如 P内酰胺类和氨基糖昔类药物的联合；多粘菌素和0内酰胺类或氨基糖苜类的联合：快效 杀菌剂和快效抑菌剂的联合用药常可导致相互拮抗作用，如B内酰胺类药物和四环素类抗菌 药物，大环内酯类和林可霊素类或氯氨苯醇类抗菌药物的联用等：慢效

16、杀菌剂和快效抑菌 剂联合用药可起到累加或协同的作用，如多粘菌素或氨基糖昔类药物和四环素或大环内酯类 或林可監素的联合使用：快效杀菌剂和慢效抑菌剂联用往往无增效作用，如B内酰胺类抗 菌药物和磺胺药物的联用。联合药敏试验的方法有：纸片扩散法联合药敏试脸：选择2种相关药物纸片贴于已涂布受试菌的药敏平板，2 纸片中心间距为24mm左右。35C孵冇2824小时后读取结果。重叠纸片法：将选定的含药纸片分别作单个和2种纸片重叠扩散药敏试验，比较各 自的抑菌环直径，判断二种药物是协同或拮抗作用。棋盘滴左法：又称方阵测试联合效果法。将2种药物以不同比例混合，对受试菌测 定MIC。比较2种药混合后的MIC和单独药

17、物MIC值，并通过计算抑菌浓度指数(FIC)来判断 2种药是否具有协同或拮抗作用。苛养菌的药敏试验苛养菌是指一类需要特殊营养成分才能生长繁殖的细菌，如淋病奈瑟菌、嗜血杆菌及肺 炎链球菌等。.淋病奈瑟菌的药敏试验可采用纸片扩散法和稀释法进行。但需在含1%添加剂的淋病 奈瑟菌GC平板上进行。操作方法同纸片扩散法和稀释法。在35C5%CO2孵冇2024 小时后测量抑菌环直径。可选用头抱克衍、头泡噬脖、头泡泊府、头抱卩坐弼、头抱曲松等抗生素中的12种， 头抱西丁、头抱咲辛、头抱替坦、环丙沙星或氧氟沙星、青霊素G、壮观霉素、四环素等进 行测泄。对于分离的菌株可测泄B内酰胺酶，阳性结果预示青赛素G等耐药。

18、嗜I血杆菌属的药敏试验 以下抗菌药物：阿奠西林/克拉维酸、头抱克洛、头泡丙烯、 氯碳头泡、头抱地尼、头砲克问、头抱泊肠、口服头抱咲辛酯、阿奇廉素和克拉篷素等对单 一嗜血杆菌感染患者的治疗往往不需进行敏感试验，仅在耐药性监测或流行病学调查时才进 行。从脑膜炎、败血症、会厌炎和而部蜂窝炎等重危患者的血液和脑脊液中分离到的流感嗜 血杆菌，应进行常规试验并报告氨节西林、一种三代头抱菌素、氯签素和美洛培南的药敏结 果。氨节西林敏感试验测左的结果，可预报阿莫西林的活性：大多数耐氨节四林和阿奠西林 的流感嗜血杆菌分离株产生TEM型B内酰胺酶。从细菌性脑膜炎及败血症患者标本中分离 的嗜血杆菌，应直接作B内酰胺

19、酶试验，阻快速检出氨节四林和阿莫西林耐药菌株。可用纸片扩散法和稀释法进行药敏试验。纸片扩散法使用嗜血杆菌专用HTM培养基， 操作同纸片扩散法。接种物制备按直接菌悬液法。稀释法用HTM肉汤。可在常规条件下孵 育2024小时报告，而不一定在5%CO2的环境下。肺炎链球菌的药敏试验 在M-H琼脂中添加5%绵羊血，倾注平板用于肺炎链球菌的 纸片扩散法试验，接种后垃5%CO2、35C孵冇2024小时观察结果，英他操作同纸片扩散 法。大多数抗菌药物需要用含2%5%(v/v)溶解马血的阳离子调节的M-H肉汤(AMHB-LHB) 作为基质，稀释抗菌药物，进行稀释法测定。肺炎链球菌药敏试验抗菌药物选择方案：(1

20、)首选试验和报告的抗菌药物：青赛素G(或苯哇西林)、红赛素，四环素，复方新诺明、 氧氟沙星或左氧氟沙星或司帕沙星，万古霊素。也闻！次选试验和报告的抗菌药物：氯霊素，利福平。可用阿莫西林、氨节西林、头抱毗脖、头抱曲松、头抱咲辛、亚胺培南和美洛培南 治疗肺炎链球菌感染，但体外敏感性使用稀释法测定。从危重患者(如脑膜炎、败血症)的血液和脑脊液中分离到肺炎链球菌，常规使用稀释 法测左青霉素G、头抱噬脖、头砲曲松和亚胺培南的MICo其他标本的培养物可用苯卩坐西林 筛选试验，若苯卩坐西林抑菌环19mm,应测青霉素G、头袍噬肪和头抱曲松的MIC。氧氟沙 星敏感的肺炎链球菌，左氧氟沙星也敏感：利福平不能单独用于治疗。其他细菌药敏试验李斯特菌属 肉汤稀释法测泄。用含2%5%(v / v)溶解马血的经阳离子调节的M-H 肉汤(AMHB-LHB)作为基质，稀释抗菌药物，接种后35C培养2620小时读取结果。氨节西 林2ug/mk青霉素G2ug/ml为敏感。本菌对头抱菌素类抗生素药敏试验结果往往 敏感，而临床实际疗效不佳，均应报告耐药。幽门螺杆菌使用琼脂稀释法。用含5%(v/v)溶解绵羊血的M-H琼脂作为基质稀释抗 菌药物。取72小时幽门螺杆菌