同济医院检验科ISO15189体系文件14细菌鉴定及药敏试验（仪器法）

1、同济大学附属同济医院检验科微生物组项目操作指导书TJYYJYKWSW/XMZ114第2版标题：细菌鉴定及药敏试验（仪器法）第1章 第14号第 PAGE 8 页 共 NUMPAGES 8 页1 VITEK-32 全自动细菌鉴定药敏分析系统:1.1 基本原理: 参见：“VITEK-32全自动微生物分析系统标准操作程序”。1.2 基本结构:1.2.1 菌液充填装置: 为一真空仓，试管中的菌悬液用弯塑料管与测试卡进样孔相连，真空仓的负压可使菌液充入测试卡内。采用塑料头将充完菌液的试卡密封。1.2.2 读数器/孵箱:由计算机控制下的孵箱，带有一光电比色读数头。读数器采用665nm波长的光扫描器，孵育箱内

2、的直立圆柱转盘每隔90o置一卡片架位，共可放个卡片架，每个架子可放张卡片，总数为32张。1.2.3 工作站:VITEK系统是采用IBM公司所生产的RISC6000工作站来进行数据收集分析及储存40000名以上受检者的人口统计和实验数据，有多种媒体拷贝数据，采用图示软件、鼠标操作。计算机软件包括处理软件、专家系统软件及药品管理软件等。具有28种流行病学和统计报告，包括菌种发生率、敏感率统计、抗生素累积敏感性、敏感率累积MIC报告、每月细菌发生率、每月细菌敏感率、工作量、生物模式统计，以及根据不同测试卡种类统计的敏感率等报告。每一种报告有41种可变参数，根据不同目的，改变某一参数时即可产生不同的流

3、行病学报告。1.2.4 测试卡: 含有鉴定卡10种，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、厌氧菌、嗜血杆菌、奈瑟菌、肠道致病菌、芽胞杆菌、非发酵革兰阴性菌和快速革兰阴性杆菌鉴定卡GNI。还有尿标本的细菌计数和鉴定，含有各种不同抗生素组合的药敏试卡共26种、其中革兰阴性杆菌的药敏试卡20余种，革兰阳性菌药敏试卡3种，还有尿道分离菌的药敏试卡，超广谱B-内酰胺酶测试卡等1.3 操作要点1.3.1 制备菌液: 按不同测试卡的要求，配制不同浓度的纯的菌悬液，如GPI需0.5个麦氏单位、GNI 个麦氏单位、YBC 2个麦氏单位、ANI 3个麦氏单位、GNS从1个麦氏单位菌悬液取50ul加入1.8ml无菌盐水

4、中,GNS从0.5个麦氏单位菌悬液取200ul加入1.8ml无菌盐水中。1.3.2 菌液接种与封口。1.3.3 将测试卡置入读数器/孵箱。1.3.4 输入受检者资料。1.3.5 自动打印实验室和临床报告。1.4 功能与特点1.4.1 鉴定功能: 快速鉴定革兰阳性、革兰阴性细菌、苛氧菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。1.4.2 药敏试验: 具有20多种药敏试卡、97种抗生素和测定超广谱-内酰胺酶（ESBLs）测试卡，快速检测细菌药敏情况。 1.4.3 动态分析原理提供最佳状态的特异性和敏感性，鉴定速度增快。1.4.4 软件系统设有质控和专家系统可针对鉴定和药敏结果人工智能分析。1.5 质量

5、控制1.5.1 质控菌株: 金黄色葡萄球菌ATCC29213，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。1.5.2 质控方法: 将质控菌株接种M-H平板，培养过夜，与测试标本一样操作接种药敏卡。要求测试结果( MIC)符合NCCLS规定的范围。如表1、表2所示。1.5.3 VITEK 系统质控软件操作1.5.3.1 设置QC 到系统的主菜单界面中点击VITEK，再点击SUT UP在里面找到Transfer Finalized Card to Quality Control System把前面的按钮点下去，然后保存退出，顺序如下：viteksetupconfiguration

6、点中Transfer Finalized Card to Quality Control SystemSaveQuit。1.5.3.2 输入QC的资料 点击QC到下拉菜单进入Reference里，在TEST TYPE里输入药敏卡片的类型，在ORGANISM ATCC后面点击？选进行质控药敏卡的标准菌株，然后在RERRENCE NUMBER里输入平时用不到的号码（一种药敏卡、一种细菌一个号），然后保存退出。按下面顺序进行：QcReferenceTest TypeOrganism ATCCReference NumberSaveQuit.1.5.3.3 输入卡片资料 点击QC,点击LOT MAIN

7、TENANCE的TEST TYPE里输入药敏卡的类型，在LOT NUMBER输入包装盒上的货号，然后在ISOLATE NUMBER点下拉菜单选0，在把下面所有要求填写日期的空框里填写日期，在NUMBER RECEIVED里填写购买该卡片的数量（盒）。 QcLot MaintenanceTest TypeLot NumberIsolate Number 点下拉菜单选0填写下面所有要求填写日期的空框Number Received订货量。1.5.3.4 查看QC 点击QC在VIEW RESULT里查看已做过的QC资料。1.5.3.5 注意事项 所有QC资料只有在卡片进入机器前进行输入，如结果报出卡片

8、取出则无法输入已做完的QC资料。表1 GNS-121 测试质控菌株预期结果大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单胞菌ATCC27853阿米卡星2-82-4阿莫西林/克拉维酸832氨苄西林2-832头孢唑啉832头孢替坦1664头孢他啶88头孢曲松88-64环丙沙星0.50.5-1庆大霉素0.5-10.5-2亚胺培南44左氧氟沙星11-2呋喃妥因32128哌拉西林/三坐巴坦88妥布霉素0.5-10.5-1甲氧苄啶/磺胺甲恶唑10160-320ESBL（CTX）NEG 表2 GPS-110测试质控菌株预期结果 抗菌素金黄色葡萄球菌ATCC29213粪肠球菌ATCC29212氨苄西林/舒巴坦4头孢唑啉

9、8克林霉素0.54-8红霉素0.5-11-4庆大霉素2庆大霉素500-SYN-S左氧氟沙星力奈唑烷莫昔沙星12-40.251-22-40.25-0.5呋喃妥因3232苯唑西林0.25-0.5青霉素G16+1-4利福平1链霉素2000-SYN-S四环素18-16甲氧苄啶/磺胺甲恶唑1010万古霉素0.5-21-4B-内酰胺酶POS2. API 微量鉴定系统:2.1 鉴定原理: API试条中的小孔内含有微量生化反应试剂，加入一定浓度的待检菌液后，在一定条件（35）下孵育一定时间（2-24H）,基质的颜色即可发生改变，依据判读标准判读结果，并将结果转化为数码（每3个生化反应为一组，第1项反应阳性为“

10、4”， 第2项反应阳性为“2”， 第3项反应阳性为“1”，各项反应阴性记为“0”，将每组3项反应的阴、阳性结果转换成数值并相加得到一组编码，查询菌码索引手册或判读软件得出鉴定结果。2.2 基本组成:2.2.1 各种类型的API板条: API 20E鉴定肠杆菌科细菌；API 20NE鉴定非肠杆菌科革兰阴性菌；API Staph鉴定葡萄球菌属和微球菌属；API Strep鉴定链球菌属；API Coryne鉴定棒状杆菌属；API 50CHB鉴定芽胞杆菌属等革兰阳性杆菌；API NH鉴定奈瑟菌属、布兰汉菌属和嗜血杆菌属；API Campy鉴定弯曲杆菌和螺杆菌；API 20A鉴定厌氧菌。2.2.3 配套

11、试剂: 氧化酶、吲哚、VP和硝酸盐试剂等。2.2.4 菌码索引手册或API LAB判读软件。2.3 操作要点: 挑取纯菌落制备菌悬液，接种至API条板的小孔内，将ADH、LDC、ODC、URE和H2S加满石蜡油，35孵育18-24h，判定并记录数码，查阅API编码手册得出鉴定结果。 功能特点:具有简易化、微量化、系统化、商品化和表准化等优点。3 其它生化鉴定试验（手工）3.1 吲哚试验3.1.1 原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，吲哚可与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。3.1.2 方法：待检菌接种蛋白胨水培养基，于35培养过夜，沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂约0.5m

12、l使成两层，观察结果。出现红色为阳性，不变色为阴性。3.1.3 用途：主要用于肠杆菌科细菌鉴定用。3.1.4 注意事项：蛋白胨必须含色氨酸。 Kovac 氏试剂应保存于带玻璃盖的棕色瓶中。时间不宜过长，否则敏感度降低。有些细菌如黄杆菌产吲哚量少，必须用二甲苯或乙醚提取浓缩后才能与吲哚试剂起反应，否则就难以检出。3.1.5 质量控制：大肠埃希菌：阳性； 肺炎克雷伯菌：阴性3.2 过氧化氢酶试验3.2.1 原理：H2O2 在过氧化氢酶催化下产生水，同时释放出O2。3.2.2 试剂：3 % H2O2 溶液。置棕色瓶内于4暗处保存。3.2.3 方法：挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，滴加3 %

13、 H2O2溶液12滴。1分钟内产生大量气泡为阳性，不产气泡为阴性。3.2.4 注意事项：注意H2O2为3 %，用商品30 % H2O2时应稀释10倍；不允许在培养基上做试验。每次试验时，应以阳性和阴性菌株做对照。3.2.5 质量控制：金黄色葡萄球菌：阳性； 草绿色链球菌：阴性3.3 血浆凝固酶试验3.3.1 原理：致病性葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝固酶，可用玻片法测出；另一种是菌体生成后释放于培养基中，叫做游离凝固酶，可用试管法测出。3.3.2 方法3.3.2.1 玻片法：取一滴生理盐水于

14、洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于盐水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环血浆混合，立即观察结果，出现明显凝快为阳性，否则为阴性。 注意： 立即观察结果。 必须制备很浓的菌悬液。 血浆以EDTA抗凝的兔血浆为最好。3.3.2.2 试管法：用生理盐水将血浆41稀释，取0.5mL。然后挑取3-5个菌落于稀释血浆中，制成浓菌液。置37水浴34小时观察结果，凝固者为阳性。观察到24小时，不凝固者为阴性。试验时应同时作阴性和阳性对照。3.3.3 质量控制：金黄色葡萄球菌：阳性；表皮葡萄球菌：阴性3.4 胶乳凝集法快速检测金黄色葡萄球菌(商品试剂盒)3.4.1 原理 Slidex Staph

15、Plus 胶乳凝集试剂采用了包被有人类纤维蛋白原和单克隆抗体的蓝色胶乳颗粒，因此可同时检出：凝集因子、蛋白A、周边荚膜上的特异抗原。由金黄色葡萄球菌引起的阳性反应将产生肉眼可辨的胶乳凝集颗粒。3.4.2 操作方法3.4.2.1 取反应卡片一张，选择两个相邻的反应圈，标注编号，其中一个反应圈加入一小滴试剂R1, 另一个反应圈加入一小滴试剂R2。3.4.2.2 分别使用二根不同的搅拌棒或塑料接种环取菌落于环内，均匀混合菌落和试剂10秒，并将胶乳试剂在整个反应圈铺开，缓缓摇动反应卡20秒，观察有无胶乳凝集产生。3.4.2.3 在30秒内，R1反应圈凝集， R2反应圈不凝集为阳性，均不凝集为阴性。R2

16、反应圈出现凝集，反应无效。3.4.3 质量控制：金黄色葡萄球菌：阳性；表皮葡萄球菌：阴性3.5 CAMP试验3.5.1 原理：B群链球菌产生一种“CAMP”因子，此物质能促进葡萄球菌的溶血素的活性。因此可在两种细菌的交界处溶血力增强，出现箭头型的透明溶血区。3.5.2 方法：首先在血平板上接种一长条金黄色葡萄球菌，再将被检菌与金黄色葡萄球菌接种线垂直接种一短线，两者间距离3mm左右。同时在被检菌接种线对侧，以金黄色葡萄球菌接种线为对称轴，用同样的方法接种阴性和阳性对照菌。35 孵育过夜。在被检菌接种线与金黄色葡萄球菌接种线之间有一个箭头形溶血区，CAMP试验阳性。3.5.3 质量控制：B群链球

17、菌：阳性； A群链球菌：阴性3.6 氧化酶试验3.6.1 原理：氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，作氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素氧化，然后此氧化型细胞色素再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验的结果又与细胞色素的存在有关。3.6.2 材料：直径6mm左右新华定性滤纸片。将滤纸片在 盐酸二甲基对苯二胺溶液中浸泡约5min取出，置35温箱烘干，剪成细条状，防潮保存。3.6.2 方法：取氧化酶纸片一张，轻轻刮取平板上的菌落，纸张变红为阳性，不变色为阴性。3.6.4 注意事项：试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。3.6.5 对照：阳性菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853，阴性菌株：大肠埃希氏菌ATCC259223.7 盐酸乙基氢化羟基奎宁（optochin） 敏感试验3.7.1 原理： optochin 即乙基氢化铜蛋白，从结构上看类似奎宁，故有人又称其为盐酸乙基氢化羟基奎宁。 该药物对肺炎链球菌的作用机制很可能是干扰叶酸的生物合成，但由于药物本身有强烈的毒素，故仅可用于临床细菌学的