外源基因的表达1-课件

1、第六章 外源基因的表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法那么central dogma。 基因表达： 克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中 表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。 最正确的基因表达体系： 目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易别离纯化。1 基因表达的机制2 基因表达的调控元件3 外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和别离纯化第六章 外源基因的表达1 基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性1.3 外源基因mRNA的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性

2、1.5 目的基因沉默1.2 mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。 mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。对原核细胞来说，最正确的方法是选择一个RNase缺失的受体菌。真核细胞来说，那么需要考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。1 基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性1.

3、3 外源基因mRNA的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默1.3 外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的根本原那么：AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。 真核细胞mRNA的5非翻译区含有共同的序列5 -CCAGCCATGG- 3。不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子major codon稀有密码子rare codon如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组

4、的主密码子相同或接近，那么该基因表达的效率就高；反之，假设外源基因含有较多的稀有密码子，其表达效率就低。1 基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性1.3 外源基因mRNA的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素。 1构建融合蛋白表达系统。 2 构建分泌蛋白表达系统。 3构建包涵体表达系统。 4选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。1 基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性1.3 外源

5、基mRNA的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默1.5 目的基因沉默基因沉默的作用机制位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：基因沉默gene silencing是导致外源基因不能正常表达的重要因素。共抑制cosuppression是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。1 基因表达的机制2 基因表达的调控元件3 外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和别离纯化第六章 外源基因的表达2 基因表达的调控元件2.1 启动子2.2 增强子2.3 终止子2.4 衰减子2.5 绝缘子2.6 反义子2.

6、1 启动子启动子promoter：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。*启动子的特征序列特异性方向性位置特性种属特异性TTGACATATAAT转录起始点53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45原核生物的PromoterRNA pol IITFIIDTAFs TBP Pol III 启 动 子 TFIIIB TFIIIC TBP RNA pol III Pol I 启 动 子 RNA pol I SL1 UBF1 TBP Pol II 启 动 子

7、 转录起始点 TATA 2 基因表达的调控元件2.1 启动子2.2 增强子2.3 终止子2.4 衰减子2.5 绝缘子2.6 反义子 2.2 增强子增强子enhancer：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。增强子的特性：双向性。重复序列。增强子行使功能与所处的位置无关。特异性。增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。2 基因表达的调控元件2.1 启动子2.2 增强子2.3 终止子2.4 衰减子2.5 绝缘子2.6 反义子2.3 终止子本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅

8、助因子。2.4 衰减子 衰减子attenuator是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。弱化子色氨酸浓度高时色氨酸浓度低时2.5 绝缘子绝缘子insulator：既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用； 2.6 反义子反义RNAantisence RNA：同某种天然mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA。反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。反义子在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。反义RNA

9、作为调节物质的作用机制：与mRNA上核糖体结合位点结合，使得翻译不能起始；与mRNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物；与转录产物结合，使转录提前终止。1 基因表达的机制2 基因表达的调控元件3 外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和别离纯化第六章 外源基因的表达 3 外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入适宜的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物目的蛋白。外源基因表达系统基因表达载体受体细胞基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细

10、胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。 3.1 大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌革兰氏阴性细菌；目前应用最广泛的基因表达系统。大肠杆菌表达系统的优越性：掌握了大肠杆菌根底生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有深刻了解；大肠杆菌已被开展成为一种平安的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；实验已经证明，许多克隆的真核基因，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、本钱低廉，易于进行工业化批量生产。3.1.1 大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠

11、杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统1DNA复制及重组载体的选择系统 复制子常见的复制子pMB1、p15A、ColE1: 松弛复制型，每细胞质粒拷贝数1020个。pSC101: 严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。选择标记绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，多为氨苄青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等。原因：许多质粒本身带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。大肠杆菌基因表达

12、载体的3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统2外源目的基因的转录系统包括启动子 和转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差异，在不同的宿主中表达效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。启动子外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。P tac = 3 P trp = 11 P lac启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A

13、C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 转录终止子一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，防止多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，防止质粒上其它基因的异常表达。大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统3蛋白质的翻译系统在原核生

14、物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点SD序列、起始密码子于SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5端非翻译序列和蛋白编码区的5端序列等。蛋白质的翻译系统核糖体结合位点SD序列翻译起始密码子翻译终止密码子核糖体结合位点 RBS SD序列与核糖体16S rRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻译起着决定性的作用。大肠杆菌SD序列的碱基组成、与起始密码子之间的距离和碱基组成对保证准确和高效翻译很重要。 SDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCA翻译起始密码子AUG91% GUG8% UUG1%翻译终止密码子翻译终止密

15、码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。 UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。主要密码子和稀有密码子如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，那么该基因的表达效率就高；反之，假设外源基因含有较多的稀有密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。3.1.1 大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统3.1.4

16、 外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略3.1.2 宿主菌 外源基因在大肠杆菌中的高表达会造成异源蛋白在细胞内大量积累，而异源蛋白易被细胞内的酶所降解。其主要原因是： * 大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加工系统； * 不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构及众多基因表达产物的稳定因子； * 高效表达的异源重组蛋白在细胞内形成高浓度微环境，增强蛋白分子相互作用。常见的大肠杆菌基因表达受体菌株3.1.1 大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略3.1.3 常

17、见的大肠杆菌表达系统Lac和Tac表达系统：以lac操纵子调控机制为根底设计和构建的表达系统。PL和PR表达系统：以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。T7表达系统：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。3.1.1 大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式 1包涵体型异源蛋白 2融合蛋白 3 分泌蛋白 4寡聚型外源蛋白 5整合型外源蛋白 3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式A包涵体型异源蛋白 包涵体：在一定条件

18、下，外源基因的表达产物在细胞中累积，致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构。 结构特点：具有正确的氨基酸序列，但空间结构是错误的，无生物学活性。 优点：简化了外源基因表达产物的别离纯化程序。B融合型异源蛋白融合蛋白：外源蛋白基因和受体菌自身蛋白基因重组在一起，不改变两个基因阅读框。 受体菌蛋白位于N端，外源蛋白在C端。 特点：受体菌蛋白与异源蛋白形成良好的杂合构象，使得多肽链上的蛋白酶切位点隐藏在蛋白分子内部而不易被切割，因而大大增加了产物的稳定性。C寡聚型异源蛋白 在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋

19、白。多表达单元重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。该方式适合表达相对分子质量较大的蛋白。多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达中等大小分子量的外源蛋白。多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达外源小分子蛋白或多肽。D整合型异源蛋白 将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使

20、之成为染色体结构的一局部而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理 E分泌型蛋白将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直接进入到培养基中。 优点：增大表达蛋白的稳定性，简化后续的别离纯化步骤3.1.1 大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略3.1.5 外源基因的高效表达策略优化表达载体：高效启动子提高稀有密码子tRNA的表达提高mRNA稳定性提高外源基因表达产物的稳定性优化发酵过程

21、3 外源基因表达系统基因表达系统原核生物基因表达系统：大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统 蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：酵母表达系统 植物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统等。1 基因表达的机制2 基因表达的调控元件3 外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和别离纯化4.1 基因表达产物的检测4.2 基因表达产物的别离纯化4.1 基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。检测特异性mRNA的方法Northern杂交法检测特异性蛋白质的方法生化反响检测法免疫学检测法生物学活性检测法当转化的外源目的基因表达产物没有可供

22、直接检测的性质时，可把外源基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。4.1.1 外源基因转录产物的检测Northern杂交4.1.2 报告基因的酶法检测： -葡萄糖苷酸酶基因gus基因、氯霉素乙酰转移酶基因cat基因、冠瘿碱合成酶基因、抗卡那霉素基因npt-基因等。4.1.3 免疫学检测免疫沉淀法酶联免疫吸附法Western印迹法固相放射免疫法4.1.4 表达产物生物学活性检测4.1 基因表达产物的检测4.2 基因表达产物的别离纯化基因表达产物别离纯化的步骤：细胞破碎离心别离柱层析电泳4.2.1 细胞的破碎对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。常见的细胞破碎方式变性剂裂解法超声波破碎法机械破碎法酶裂解法4.2.2 离心离心力一般在数万g范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等；高速离心：超速离心：离心力一般100,000g以上，可用来去除细胞膜碎片等高分子复合物。附：离心力和转速的换算公式：RCF=11.18(N/1000)2rRCF：相对离心力，单位为重力加速度gN：转头旋转速度转速，用r/min表示r：转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为厘米cm4.2.3 特异性表达蛋白的初步别离沉淀法：超滤浓缩法