嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌黏附拮抗作用的研究

1、嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌黏附拮抗作用的研究【摘要】目的研究热灭活状态和活菌状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌(Hp)的黏附拮抗作用。方法制备人胃上皮腺癌细胞系AGS细胞爬片，将两种状态嗜酸乳杆菌和不同形态Hp菌分组按不同顺序参加，作用2h，革兰染色后光镜观察分析Hp黏附指数产生的变化，荧光抗体染色法定性评价黏附于AGS细胞的Hp密度的改变。结果革兰染色后光镜观察分析：排除实验组及竞争实验组与对照组比拟，黏附指数均有明显下降P0.05。荧光镜下可见实验组黏附于细胞的Hp密度也明显降低。结论嗜酸乳杆菌对不同形态的Hp均具有黏附拮抗作用。【关键词】乳杆菌,嗜酸;螺杆菌,幽门;上皮细胞;

2、胃肿瘤;细菌黏附;荧光抗体技术TheAntagnisEffetfLatbaillusAidphilusnAdherenefHelialandidFrsfHelibaterpylriUXiaqian,SHEFEifEI,LINeng,HENYuexiuDepartentfPathgenyBilgy,FujianedialUniversity,Fuzhu350004,hina幽门螺杆菌(Helibaterpylri,Hp)存在2种形态：螺旋野生形和球形变异形。在不利于其生长繁殖的环境中，螺旋形Hp可转变为球形。球形Hp在细菌的传播及致病中也起着重要作用。笔者拟从细菌感染的第一步，即嗜酸乳杆菌对2种

3、形态Hp的黏附才能的影响讨论将嗜酸乳杆菌同时作为预防和治疗Hp感染常规辅助手段的可行性。1材料与方法1.1菌株与培养嗜酸乳杆菌Latbaillusaidphilus标准株6075源自中国工业微生物菌种保藏中心。Hp国际标准株NT11637为本系保存。1.1.1嗜酸乳杆菌制备采用RS液体培养基在厌氧环境下37静止培养36h，搜集菌液分为活菌和灭活2组，灭活组经75水浴灭活30in。无血清无双抗的F12高糖培养液重悬。1.1.2螺旋形Hp制备用含5%新颖脱纤维羊血的布氏血平板上含万古霉素10g/L，多粘菌素B2.5IU/L，TP5g/L，37微氧环境中培养和传代。传代后再培养2d的螺旋形Hp以PB

4、S洗下，无血清无双抗的F12高糖培养液重悬。1.1.3球形Hp制备将Hp传代后再培养2d，用布氏肉汤含10%小牛血清洗下细菌，制成菌悬液。参加灭滴灵终浓度8g/L，37微氧环境培养，直至Hp全部转为球形约60h。经显微镜下观察及再培养无菌生长，确定为Hp已完全球变。以无血清无双抗的F12高糖培养液重悬细菌备用。1.2细胞培养和细胞爬片制备人胃上皮腺癌细胞系AGS细胞由本系保存，培养液为含10%胎牛血清的F12高糖培养液含10%胎牛血清，青霉素200IU/L，链霉素50g/L。置于体积分数为0.05的2培养箱中培养，隔天传代，实验所用细胞均处于对数生长期。于6孔板内置盖玻片，每孔接种1105L-

5、1密度的细胞液2L，过夜培养，制成爬片。1.3兔抗Hp11637多克隆抗体制备1.4不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp黏附拮抗研究1.4.1光镜观察并计算黏附指数1.4.1.1观察分析不同状态的嗜酸乳杆菌对AGS细胞的黏附情况将活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌参加6孔培养板中，在37、体积分数为0.05的2环境中与AGS细胞作用2h。每孔菌液2L，细菌浓度为5107FU/L。作用完毕后，取出细胞爬片，PBS洗3次，常规革兰染色后于油镜下观察并随机计数50个细胞上活菌或热灭活状态的嗜酸乳杆菌的黏附数量。推算出每个上皮细胞的黏附指数：转贴于论文联盟.ll.黏附指数=黏附嗜酸乳杆菌数/细胞数1.4.1

6、.2通过排除、竞争、交换实验观察分析不同状态的嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp黏附才能的影响1排除实验组：将活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌参加6孔培养板中，在37，体积分数为0.05的2环境中与AGS细胞作用1h，去除未黏附的嗜酸乳杆菌,然后再分别参加螺旋形Hp、球形Hp悬液，继续孵育1h；(2)竞争实验组：分别将螺旋形Hp、球形Hp悬液与嗜酸乳杆菌活菌组或灭活组悬液同时参加6孔培养板中混匀，37、体积分数为0.05的2环境中与AGS细胞作用2h；(3)交换实验组：将螺旋形Hp、球形Hp悬液参加6孔板中，37、体积分数为0.05的2环境中与AGS细胞作用1h后，去除未黏附的螺旋形Hp、球形Hp，再参

7、加活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌悬液，混匀后继续孵育1h。(4)对照组：将螺旋形Hp、球形Hp悬液参加6孔板中，37、体积分数为0.05的2环境中与AGS细胞作用2h。每孔菌液2L，每孔中嗜酸乳杆菌及Hp菌量分别到达108个。作用完毕后，取出细胞爬片，PBS洗3次，常规革兰染色后于油镜下观察并随机计数50个细胞上螺旋形Hp、球形Hp的黏附数量。推算出每个上皮细胞的黏附指数:黏附指数=黏附螺旋形Hp或球形Hp数/细胞数1.4.2荧光抗体染色法定性评价嗜酸乳杆菌的参加对不同形态Hp黏附细胞的密度影响将制备的细胞爬片分组：螺旋形Hp组、球形Hp组，对照组、如1.4.1.2的排除实验组、竞争实验组、交换

8、实验组。每孔菌液2L，除对照孔加2L无血清F12高糖培养液外，其余各组每孔中嗜酸乳杆菌及Hp菌量分别到达108个。螺旋形Hp组、球形Hp组及对照组孵育2h，排除实验组、竞争实验组及交换实验组孵育时间参照1.4.1.2。各组细胞片经PBS洗3次，兔抗11637多克隆抗体37作用30in，PBS洗3次，用FIT标记的羊抗兔抗体购自武汉博士德生物工程作用30in，经洗涤封片后于荧光显微镜下观察并拍照。实验重复3次。1.5统计学处理黏附指数以xs表示，采用SPSS12.0统计软件分析，比拟采用成组t检验。2结果2.1不同状态嗜酸乳杆菌对AGS细胞的黏附情况革兰染色后油镜下观察可见：活菌状态的嗜酸乳杆菌

9、和灭活状态的嗜酸乳杆菌均对AGS细胞具有较强的黏附活性。活菌状态的嗜酸乳杆菌黏附指数53.0013.14与灭活状态的嗜酸乳杆菌黏附指数42.0011.47比拟，差异无统计学意义P0.05。2.2不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp细胞黏附指数的影响2.2.1不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形Hp黏附AGS细胞的影响革兰染色后油镜下可见：螺旋形Hp对AGS细胞具有很强黏附活性。嗜酸乳杆菌先于Hp排除实验组或同时与Hp竞争实验组，图1A参加细胞中，那么螺旋形Hp对AGS细胞的黏附指数明显下降P0.05。假设嗜酸乳杆菌后于Hp交换实验组参加细胞中，那么螺旋形Hp对AGS细胞的黏附指数无明显变化P0.05。同

10、一实验组中，参加灭活状态的嗜酸乳杆菌组与参加活菌组比拟，其Hp对AGS细胞的黏附指数均较低，差异无统计学意义P0.05，表1。表1不同状态嗜酸乳杆菌对螺旋形Hp黏附AGS细胞的影响略2.2.2不同状态嗜酸乳杆菌对球形Hp黏附AGS细胞的影响革兰染色后油镜下可见：球形Hp虽然黏附才能略有下降，但仍保持较强黏附活性。嗜酸乳杆菌先于Hp排除实验组或同时与Hp竞争实验组，图1B参加细胞中，那么球形Hp对AGS细胞的黏附指数明显下降P0.05。假设嗜酸乳杆菌后于Hp交换实验组参加细胞中，那么球形Hp对AGS细胞的黏附指数无明显变化P0.05。同一实验组中，参加灭活状态的嗜酸乳杆菌组与参加活菌组比拟，其Hp对AGS细胞的黏附指数均较低，差异无统计学意义P0.05，表2。2.3荧光抗体染色法定性评价嗜酸乳杆菌的参加对不同形态Hp