中药质量标准价的分子免疫学研究

1、中药质量标准价的分子免疫学研究摘要：中药的质量标准研究除少量采用形态法(包括显微)外，一般均用现代理化分析方法。直到1995年版药典，中药质量标准尚未有分子生物学理论和方法的应用，这与当今分子生物学的开展是极不相称的，也不利于中药自身开展及指导临床。应当以中药品种分子遗传特征进展中药质量标准研究的新思路。主题词：中药质量标准分子免疫学研究一、免疫学研究特点大多数植物的初级或次级代谢产物，因其专属性强，又可与化学对照品比拟测定，常作为中药质量标准或指标性成分。但是单一化学成分所携信息量有限，不同亲缘种，亚种间常含一样成分，例如黄柏与黄连均含小檗碱。同一品种在环境因素作用下也可能含不同质和量的化学

2、成分。至于动物类中药，由于缺乏特异的次级代谢产物，更难以某种“化学成分进展专属鉴别。分子生物学研究决定遗传特征的信息大分子，包括DNA、RNA及蛋白质，故可针对中药的物种进展鉴别和质量评价。以分子遗传标记进展中药鉴别，由于可以区别亲缘关系的种、亚种甚至居群，对环境因素有较大保守性，将会对中药的分类学、药剂学及质量标准研究产生极其深入的影响。我们认为以中药物种遗传特征作质量标准或者作理化分析的补充，有利于保护地道药材，有利于临床根据中医理论用药，也有利于市场防伪。由于国外容易承受药材种属遗传特征的质量观念，反而不理解诸如小檗碱作为天然黄连质量标志的习惯，所以也还有利于出口准入。对于动物类中药，甚

3、至可能成为解决专属鉴定的根本方法。二、免疫学研究现状1、传统蛋白质分析早在20多年前即有人提出以种属蛋白特征进展中药鉴别思路，先后报道氨基酸含量、电泳、同工酶及免疫血清等，至今仍在继续。主要问题是不标准，难以重复。鉴于局部中药材及制剂中蛋白已有不同程度的水解，故近年开展的X衍射、核磁共振、质谱、HP以及毛细管电泳等测定蛋白质的新技术，均难以直接用于质量标准。一般免疫化学法采用全价抗原分析，却不能用于亲缘接近的品种鉴别。2、DNA分子标记DNA作为遗传信息的直接载体，不受环境因素、个体发育阶段及组织部位影响。而且DNA化学稳定性高，在一般贮存条件下不易降解，所以近年DNA分子标记鉴别开展很快。从

4、1994年香港中文大学首次报告随机引物多聚酶反响(AP-PR或RAPD)鉴别人参和西洋参以来，鉴别的中药已达3040个品种，有的甚至申请了专利。但是目前DNA鉴别仍限于中药材的分析，对于多种中药组成的复方制剂，随机多态分析技术不适用于混合模板。建议加快建立重要中药材基因库，寻找出品种高度保守的特异DNA序列，合成专属的引物，才能真正应用于中药制剂的质量标准研究。3、蛋白质分子免疫标记从海王“金牡蛎胶囊生化免疫鉴别及含量测定研究工程中，提出了一个不同于传统蛋白质分析的思路。其核心是确证55KD多肽是牡蛎种属特征蛋白(抗原)，纯化并制定该蛋白质的质控条件，制成免疫学对照品。然后免疫动物制备抗体作为

5、检测药盒。采用不同方法可在10-3g及10-9g范围与其他贝类鉴别。其线性、精细度、重现性和稳定性及回收试验等方法学考察，均接近理化分析要求。实际上已用于企业内部质量标准，其后证明用此方法可检出健民“龙牡壮骨冲剂中极微量的牡蛎蛋白。转贴于论文联盟.ll.三、主要步骤及关键技术1、免疫学对照品的设立和质控1中药材种属特征蛋白确实证:能否获得含量丰富、抗原性强，既是药典规定入药的各亚种间共同蛋白，又不与其他类似品种穿插的特征多肽(抗原)，是整个质量研究成败的关键和难点。除经典的电泳分析(SDS、Native、IEF、2D电泳、糖蛋白电泳)外，推荐“免疫吸收印迹电泳技术。即先将药材提取蛋白质，免疫动

6、物制备全价抗血清，逐一参加待鉴别品种“吸收血清中穿插的抗体，然后用吸收后血清作一抗进展免疫印迹(esternblt)，未被吸收的组分极可能具特异性。再结合分子量，等电点及排除糖蛋白、脂蛋白后，可确定为该种属特征蛋白。2种属特征蛋白纯化及多克隆抗体制备:目的是对初步确证的蛋白质作进一步考察。假如仅作市场防伪或企业内部质控，提取的蛋白质只要分子量明确，SDS根本上一条带，穿插免疫单一峰，再测定蛋白质含量，即可作为粗对照品。以此免疫家兔，测定抗体滴度大于1/64，制备IgG酶结合物，已可满足应用的要求。特征蛋白纯化可从SDS直接制备，但多数情况下仍使用盐析(分子筛)或凝胶过滤(离子交换方法)制备。3

7、种属特征短肽序列分析:天然纯化的蛋白质分子量仍较大，性质不均一，其质量受提取方法影响很大，与化学对照品技术要求间隔 较大。我们认为，用于中药新药质量标准的免疫学对照品，应当具有氨基酸序列清楚、抗原性专一、稳定性强及便于制取供给等条件，只有简单线性多肽能符合这些条件。4种属特征短肽人工合成:由于抗原决定簇表达只须一级构造，可采用固相多肽合成法制备，简单过凝胶柱纯化及验证抗原性存在，即到达免疫学对照品要求。至于采用噬菌体肽库技术确定特征短肽，简并寡核苷酸合成小肽DNA片段在噬菌体颗粒外表表达这一短肽，可能更快捷有效，但我们尚无这方面的经历。2、检测试药特异抗体制备常规制备多肽抗体，可采用半抗原联接

8、蛋白形成完全抗原，产生多克隆或单克隆抗体。近年来第三代抗体，即工程抗体技术已商品化。为提供标准化的抗体库，厂家备有多个系统试剂盒。只须从免疫小鼠脾淋巴细胞或杂交瘤细胞，提取RNA与药盒的引物作PT-PR克隆Vh和Vk基因，经DNA接头连接后与噬菌体PANTAB5重组，转化大肠杆菌制备抗体进展“吸附洗脱扩增的挑选富集，再经转染即可得到高亲和力的抗该种属特征短肽的单链抗体。随基因工程技术普及，估计工程抗体消费本钱还会降低。3、专属鉴别及含量测定方法1一般免疫化学法:采用免疫沉淀技术，适用于10-3g10-5g范围特征多肽的鉴别。例如免疫双扩散用在专属鉴别及火箭电泳用来进展含量测定。该方法假阳性少，

9、质控好。2酶标记免疫法:有的中药含特征多肽量极微，如珍珠、牡蛎等，须高达10-9g以上才能检出。通常采用酶标免疫，甚至放大技术。斑点酶联免疫分析(DIBA)可以鉴别，将12l中药提取液点样在N膜上，用直接或间接酶结合抗体检测，阳性斑点呈红褐色。我们在牡蛎制剂鉴别中可达1ng。含量测定那么用酶联免疫吸收分析(ELISA)，用双抗体夹心测定牡蛎特征蛋白，在0。05g0。90g呈线性，RSD为6。6%，平均加样回收率110%，最低检测限5ng。近年来开展的增强化学发光及免疫PR技术，使检测限进步到10-12g以上，将会使分子免疫学进展中药质量标准研究更灵敏。有关人工合成对照品与天然蛋白质，工程抗体与天然抗体间反响有何差异，孰优孰劣?还有待理论后答复。分子生物学用于中药质量标准研究才刚起步，终究哪些中药适于理化分析，哪些适于DNA分析或适于分子免疫分析，也要理论后总结。目前，应当集中力量进展中药免疫学对照品研究，争取获得药检部门的