CXP软体中文简易操作说明

1、 一、基本开机步骤与软件主画面说明1. 依常规模式进入 Window20000 系统。2. 双点桌面上 ，即可启动机器并进入操作软件。此时您可见到下面的画面：3. 选取您自己的数据夹（请在 Password 处输入密码），并按下 Next 继续。接着您能看到下面的画面：1 4. 此时您能在左边的窗口选取您即将使用的 Protocol，然后按下 Finish 进入软件，或不选取任何 Protocol，直接按下 Finish 进入软件，您即可见到软件的工作区（workspace），如下图：工作清单编辑区Resource ExplorerAcquisition Manager2 工作区分成三部份：a

2、. 工具列（CXP Toolbars）:各种功能的操作工具列，包含：1. 存取工具列提供开启、储存、打印及一般 Windows 操作系统下软件的编辑功能。3 2. 绘图工具列提供绘制各种分析图形（Color dot plot、Histogram plot）及框选区域（Gating）的功能。4 3. 统计工具列设定各框选区域（Gate）的颜色、选择统计数值、并可将数据输出至 WindowExcel 软件。4. 打印页（FlowPAGE ）工具列提供编辑打印页所需的各项功能。5 5. 机器操控工具列（仅在仪器操控软件中）：操控机器的各项功能，包括：流速及机器的所有设定值。 点选icon 后，可开启

3、仪器操控窗口，包含三个卷标项目：1. Acquisition Setup Tab(Acq. Setup)2. Detector Tab(Detectors)3. Compensation Tab(Compensation)6 1. 在Acq. Setup 标签下可设定：Duration：收集Data 的时间Max. events：收集的细胞数目Acquisition mode：Setup mode：提供在线实时分析，不储存数据。QuickCOMP：提供荧光补偿滚动条，帮助快速调整荧光补偿值。QuickSET：提供电压调整滚动条，帮助快速调整每个Detectors的电压值（Volts）。Dot：

4、开启在线实时分 析模式（Setup mode）时，实时显示的细胞数目。Discriminator（阀值）的设定红光开关选项Parameters：点选进入参数选取画面，如下图 依不同实验的需求，在此画面选择想要收取的参数项目。7 2. 在 Detectors 标签下可设定每个参数的电压值（ Volts）及放大倍率值（Gain），或利用“ QuickSET ”提供的滚动条快速调整电压值。3. 在 Compensation 标签下可设定两 两参数 间的荧光补偿 值，或 利用“ QuickCOMP ”提供的荧光补偿滚动条，帮助快速调整荧光补偿值。8 工作清单编写（仅在操控版中）6.供使用者编辑工作清单

5、的内容（条件之设定请参考 p.33）。批次分析工具列（仅在分析版中）7.提供批次分析的各项设定及操控。9 8. 迭图工具列（仅在分析版中）提供绘制迭图（Overlay Plot）时所需的各项功能。10 b. 档案总管（Resource Explorer）:利用鼠标在做切换，让您能够看到您专属数据夹中的 Worklists、Panels、Protocols、LMD Data 和 HSTData 等档案。若要开启档案总管中的数据时，只需利用鼠标将这些档案直拖曳至软件的桌面上，便可打开各式档案或分析 Data。工作清单编写区（Acquisition Manager :）c.利用工作清单工具列您可以在

6、此处编写您即将要收集的样本内容，包括设定本次实验的染剂名称参数名、List Mode Data 存盘的模式.等等（条件之设定请参考 p.33）。11 二、建立一个新的使用者在 CXP 软件中，使用者可以设定自己专属的数据夹，藉由这个数据夹的设定，计算机会自动的将您在实验中设定的数据和实验时收集的 Data 储存到您专属的数据夹中，以避免不同使用者之间数据存取造成的混乱。以下步骤说明如何建立一个属于您自己的数据夹：1. 开启计算机进入 Windows 2000 系统，双点桌面上icon，即可启动机器并进入操作软件。此时您可见到下面的画面：2. 点选程序管理员（ admin）数据夹后，左下角的“

7、Admin”按键会浮现，输入Password 后，点选左下角的“Admin”，您能见到下面的画面：Add user：新增一个使用者Delete use：删除一个使用者Modify user：修改已经存在12 3. 点选“Add user”icon，您会看到下面画面：User ID：在此键入使用者姓名Password：设定要进入这个数据夹的密码。Privilege：用来设定当您使用这个使用者时存取的权限，建议您全部勾选。4. 点选 Paths 标签，您会看到下面的画面：当您建立一个新的使用者后，软 件 会 自 动 帮 您 在C:CytomicsCXPUser 这个路径中建立一个您专属的数据夹，并

8、在这个资要夹下建立数个用来储存不同类型档案的数据夹。13 5. 您也可以点选 键，将档案储存在您另外选定的数据夹中。例如：如果您想要把 LMD 档案存在 D 槽的 Data 这个数据夹中，您便可以将 LMD数据夹的路径指向 D:DATA（如下图）。如此一来，您所收集的 LMD 档案就会自动存在 D:DATA中了。6. 设定好后，按下“确定”键，您会看到一个确认的对会窗口。7. 最后按下“确定”，您便完成了一个新使用者的设定。14 三、设定一个新的 Protocol 基本观念：Protocol 档案（扩展名为 *.pro）是 Cytomics CXP 这个软件的中心骨架，您可以视它为一个空白的蓝

9、图。开启一个 Protocol 档案后，可用来收取 List Mode Data（LMD），也可用来分析之前收下来的 LMD。一个完整的 Protocol 档案包括：1. 您所选取的参数种类：FS、SS、FL15，Lin or Log。2. 您想要表现的图形：包含利用选择的参数所画的点图或直 方图，以及图上框选的区域与位置。3. 机器的设定条件：包含调整好的电压值、荧光补偿值、上样流速、Data 储存条件等。一般来说，设定一个新的 Protocol 分为以下几个步骤：1. 开启一个新的 Protocol：选择 File / new / new protocol，即可开启一个全新的 Protoc

10、ol。选择您的实验需要收取的参数：开启 Cytometer Control，点选Acq. Setup标签内的“ Parameters”icon 勾选你需要的参数。你所选取的参数将会列在对话窗口的右手边空白处。2.3. 利用您选择的参数绘制您想要表现的 Flow图形：利用绘图工具列绘制双参数图（Color Dot Plot）或单参数图（Histogram Plot），以及图上可能需要的各式框选区间。4. 确认 Discrimination是否已设定完成：开启 Cytometer Control，点选Acq. Setup 卷标，检查有对话窗口右手边的 Discrimination 值是否已设定完成

11、（通常将 Discrimination 设为 FS=100）。5. 储存此新的 Protocol檔名。6. 实际 Run样本（Control or Negative Control）调整 Volts和 Gain 值：您可以开启 Cytometer Control 中的 Detectors 标签，直接调整每个参数的Volts 和 Gain 值，也可以勾选 Cytometer Control 中的“QuickSET”选项，直接在图形上的光标滚动条做调整。此时您必须完成下列的调整：15 a.b.c.调整 FS、SS 的 Volts 和 Gain 值，让您在 FS/SS 的 Color Dot Plo

12、t 图中能看到你想要分析的细胞族群。调整荧光参数的 Volts 和 Gain 值，使荧光参数的图形中呈现出你预期的细胞分布状况。根据细胞的分布状况，调整各式框选区间的位置。7. 若您进行的是多重荧光染色的实验，则必须再逐一 Run 单一荧光染色的样本，以调整出适当的荧光补偿值：您可以开启 Cytometer Control 中的Compensation 标签，直接调整每个参数间的 Compensation 值；也可以勾选 Cytometer Control 中的“QuickCOMP”选项，直接在图形上的光标滚动条做调整（若为单色荧光实验则不需调整此项设定否）。Note:1. 在进行 Volts

13、、Gain、Compensation 等仪器条件的调整时，您必须把Acq. Setup 标签内的“Setup Mode”勾选起来，此时图形中的数据呈现动态的变动，且软件不会将数据储存起来。2. 当您完成任何一项设定的动作后，请别忘了点选 Save Protocol，以确保您辛苦的设定已做了储存。3. 以上所有的设定，都会被储存在 Protocol 这个档案中，日后您若要进行相同的实验时，仅需把以前设定好的 Protocol 叫出，就可以直接收取您实验的 Data。16 双染（FITC / PE）Surface Markers 的 Protocol 设定 设定此 Protocol，你必须准备下列

14、 4 管样本，用以调整仪器的设定值：1. Negative Control：未染色的细胞，或以 Isotype 抗体染色的细胞2. 单染 FITC 的阳性样本3. 单染 PE 的阳性样本4. 双染的阳性样本 操作步骤：a. 开启一个新的 Protocol：1. 进入 EXPO32 的软件后，点选 File/New/New Protocol（如下图），您便可以产生一个新的 Protocol（此 Protocol 的设定值为软件的原始设定值），以此为出发点，修改成为合乎您实验需求的 Protocol。2. 关闭工作区中软件自动画好的两个图形。17 b. 选择您想要收取的参数：1. 按下机器操控工具

15、列中的 Cytometer Control。2. 点选 Acq. Setup 标签中的“Parameters”键后，出现选择参数的窗口。3. 如上图方式，勾选您实验所需要的参数（在此实验中我们选择了 FS Lin、SS Lin、FL1 Log 和 FL2 Log 等四个参数），按下 OK 键，软件会问您是否要储存这个新的 Protocol，输入您想要的 Protocol 档名后，即完成参数的选择。此时在档案总管您的数据夹的 Protocol 选项中会出现你键入的这个Protocol，如下图：18 c. 绘制您想要分析的 Flow 图形：1. 回到软件工作区，在绘图工具列中点选 Color Do

16、t Plot 键下面的对话窗口：，您会看到2. 依照上图，将 X 轴的参数设为 SS Lin，Y 轴的参数设为 FS Lin，按下 OK；您便可以得到一个以 SS Lin 为 X 轴，FS Lin 为 Y 轴的双参数图（如图一）。3. 点选绘图工具列中的多边形框选或矩形框选 ，在此图中画出一个区域，计算机会自动将此区域命名为 A；您也可以利用鼠标点选 A 处，将此区域名称更改为您所希望的（如图二）。（图一）（图二）19 4. 再次点选绘图工具列中的 Color Dot Plot 键，绘制第二个双参数图。5. 依照上图，将 X 轴的参数设为 FL1 Log，Y 轴的参数设为 FL2 Log，Ga

17、te处选为 A，按下“确定”，便可以得到一个以 FL1 Log 为 X 轴，FL2 Log 为Y 轴的双参数图。接着点选绘图工具列中的十字线框选 ，将十字线订在第一个对数方格（B3）内，如下图：6. 按下 Save Protocol，储存您对这个 Protocol 所做的修改。d. 确认Discrimination是否已设定完成：开启Cytometer Control，点选 Acq. Setup卷标，检查有对话窗口右手边的 Discrimination 值是否已设定完成（SurfaceMarker 的实验中，我们通常将 Discrimination 设为 FS=100）。20 e. Run 阴

18、性样本（可使用未染色的样本，或以 Isotype 染色的阴性样本），依下列方式调整各个参数的 Volts和 Gain 值：1. 将 Cytometer Control / Acq. Setup 中的“Setup Mode”选项勾起。2. 将阴性样本放入上样 转盘中，在 Acquisition Manager 中输入 转盘号码（Carousel No.）及样品馆所放的位置（Location）。3. 按下仪器操控工具列中的 Start Acquisition，此时机器开始收集 Data，并显示在您刚画好的图形上，由于 Setup Mode 选项已勾起，此时所收集的Data 并不会储存（图形中的数据

19、呈现动态的变动）。在 Cytometer Control / Detectors中，调整 FS、SS 的 Volts 和 Gain值，直到 FS-SS 双参数图形中能够见到您想要分析的细胞族群。调整 Gate A 的位置，框选您有兴趣的细胞族群。（左图以血液样本为例，A 框选的区域为淋巴细胞）调整二：接着调整 FL1、FL2 的 Volts 值，使 FL1 / FL2双参数图形中的细胞落 在 十 字 线 左 下 角 的 方 格 内（B3 对数方格），如左图：4. 按下机器操控工具列中的放弃键结束此管样本的收集，并按下存取工具列中的 Save Protocol，将刚刚所做的设定储存起来。21 f

20、. Run 单染的阳性样本调整光补偿（Compensation）：包括两管样本：以 FL1 单染样本调整 FL2-%FL1以 FL2 单染样本调整 FL1-%FL21. 将 Cytometrer Control / Acq. Set中up的“QuickCOMP”选项勾起，此时可以在 FL1-FL2 Color Dot plot 的两侧看到调整荧光补偿值的滚动条，如下图：2. Run FL1 单染样本，直接拉动垂直滚动条，调整 FL2-%FL1 的荧光补偿值，直到 FL1 阳性细胞群的高度跟阴性细胞群的高度等高为止，如下图：阳性细胞群阴性细胞群( No Compensation )( Compe

21、nsation OK )3. 按下放弃键结束此管样本的收集，接着按下Save Protocol ，将刚刚22 您所做的设定储存起来。4. Run FL2 单染样本调，直接拉动水平滚动条，调整 FL1-%FL2 的荧光补偿值，直到 FL2 阳性细胞群的左右位置跟阴性细胞群相当为止，如下图：No CompensationCompensation set OK（Compensation OK）（No Compensation）5. 按下放弃键结束此管样本的收集，并按下 Save Protocol，将刚刚您所做的设定储存起来。此时你已完成这个 Protocol 的设定。g. Run 双染样本，正式收取

22、 Data1. 去除机器设定值启控窗口（Cytometer Control）中“Setup Mode”的勾选，并将Acquisition Limits 中的Duration设为300，Max. events设定为10000。2. 再按一次 Save Protocol，将刚刚您所做的设定储存起来。3. 将阳性双染样本放入上样转盘中，在 Acquisition Manager 中输入转盘号码及样品管所放的位置。4. 按下仪器操控工具列中的 Start Acquisition，此时机器开始收集 Data，并显示在您设定好图形上，直到累积满 10000 颗细胞时，机器会自动停止，储存 Data，并将此

23、管样本退出。此时桌面上的图形显示如下：23 欲察看各个框选区间的统计数值，可将鼠标移至双参数图形的左下角， 按下出现的符号，您可以看到计算机对各个区间所做的统计数值，如左图：如果想看其它统计值，请点选统 计 工 具 列 中 的 SelectStatistics，您便可以选择想要看的统计数值，如左图：24 附录：Surface Marker 样本之制备及染色方法一取白血球再染色1. 取得含抗凝剂(EDTA or HEPARIN)的血，放置室温。2. 用等量的 PBS 和 Blood 混合来稀释 (最大稀释比 PBS:Blood = 2 : 1 )3. 取 3 c.c Ficoll-Hypaque

24、(density 1.077) 放入 15 mL tube(or 取 12 c.c Ficoll-Hypaque 放入 50 mL tube)4. 慢慢放入稀释血 8mL (or 30mL)在 Ficoll-Hypaque 之上方，不要混淆到下层。5. 小心 balance 后，离心 400g，25min，RT6. 小心取得 mononuclear layer cells7. 加入 2 倍量的 PBS 来稀释 mononuclear layer cells8. 200g，10min，去上清液9. 重复 Step7、810. 计算细胞数 and resuspend (细胞浓度调整到接近 1x10

25、7cells/ mL)11. 保存在 4，一直到使用12. 取 100uL cells20uL mAb，Mix13. Incubation 30 min14. Resuspend to 500uL1mL with PBS (含 0.5% paraformaldehyde)15. Run within 6 hours方法二直接全血染色法1. 100ul whole blood20ul mAb.2. Incubation 15-20 min3. 500ul OptiLyse C, Mix4. incubation 10 min, RT5. 500ul PBS, Mix6. After at lea

26、st 10 min7. Run on instrument25 Cell Cycle 的 Protocol 设定a. 开启一个新的 Protocol：选择 File / new / new protocol 开启一个全新的Protocol。b. 关闭工作区中软件自动画好的两个图形。c. 选择您的实验所需要收取的参数：开启 Cytometer Control，点选 Acq. Setup标签内的“Parameters”键，勾选需要的参数，如下图：26 d. 绘制您想要分析的 Flow 图形：Cell Cycle 实验的 Protocol 需要的图形及框选区间如下：（请注意每个图形选择的 Gatin

27、g 区间）OITe. 设定 Dot Plot 中的细胞颜色：点选统计工具列中的 Create/ modify Color GatePrecedence Setup ，将框选区间的顺序及颜色设定为下列模式：27 f. 确认 Discrimination 是否已设定完成：开启 Cytometer Control，点选 Acq.Setup，检查对话窗口右手边的 Discrimination 值是否已设定完成，Cell Cycle的实验中，我们通常将 Discrimination 设为 FS=100 或 FL3 =20。g. 实际 Run 样本（已固定且以 PI 染色的健康细胞）：依下列方式调整每个参

28、数的Volts 和 Gain 值。调整 FS 和 SS 的 Volts 和 Gain 值，使大部分的细胞（主细胞群）落于FS 和 SS 的双参数图中，并调整Gate A，将主群细胞框选起来。调整 FL3 Lin 和 AUX 的 Volts和 Gain 值，把 RATIO读值最大的细胞落于图形最上面，并调整 Gate B 将最上层的细胞群框选起来。Note：RATIO 的调整包含分 子G0G1 Phase，一般常将G0G1 Phase 调整至Mean= 200300 间。（AUX）及分母（FL3 Lin），如 RATIO 值太大，可将分子（AUX）调小，或将分母调大（FL3 Lin）。28 此时

29、即可得到 Cell Cycle 的直方图，如下图：G0G1 Phase此外，检视 Double Check 的图形（FL3 Lin vs. AUX），单颗细胞（红色的点）应该分布在由左下到右上的 45 切线上。这代表您在第二个图形中的框选是正确无误的，如下图：29 Note：1. 步骤中切记观察细胞是否有群聚现象，若细胞无法拍散，则重新置备样本。2. 结果评估：Data 收取后，我们通常会检视 G0G1 Phase 的变异系数（CV 值），用以评估细胞的固定、染色过程是否完善。一般来说， 我们会要求 G0G1Phase 的 CV 值必须小于 8，代表细胞的固定过程良好，并具有均一的染色结果，如

30、下图。CV 值大于 8 的数据，必须舍弃不用。 CV 值不好的结果可能肇因于：细胞固定步骤不良 改善固定步骤，请教有经验者。使用了不当的固定试剂 更换固定试剂。染色时间不足 增加染色时间。RNase 处理时间不足 增加 RNase 处理时间。有时候可将 CV 值太高的样本再放入 37 中反应 10 分钟，即可改善结果。30 3. Cell Cycle 数据分析：要分析细胞周期中的各个时其所占的比例，可以下列两种方法进行：a. 利用可分析 List Mode Data 的软件（如 EXPO32、CytomicsCXP、WinMDI等），依照上述 Protocol 所设定的图形及框选区域来分析 D

31、ata 后，在FL3 Lin 的直方图中，由人为判断划分三个区间，软件即可算出三个区间所含细胞的比例，如上图。b. 先以 EXPO32 或 Cytomics CXP 软件分析 List Mode Data，得到 FL3 Lin直方图后，点选 File / Save Histogram Data As，将 FL3 Lin 直方图另外存成一图形文件（扩展名为 *.hst），将此图形文件利用 Cell Cycle 分析专用的软件（如 Multicycle、ModFit等）开启并分析，这类的软件会辅助判读 Cell Cycle 的各个区间，并计算比例。附录：常用的固定染色法（酒精固定法及 染色）：PI

32、Cell Cycle1. 置备悬浮细胞液，最后浓度调整约为 5106 cells/ mL。若细胞株为 Attachedcell Line，先以 Trypsin 将细胞打下，再调整浓度（注意 Trypsin 处理不可过头）。2. 取 1 mL 细胞液，以冰冷的 PBS 清洗细胞一次，离心后，倒除上清液。3. 以剩余的上清液将细胞打散（必须确定细胞已完全打散）。4. 在震荡器上（转速不可开太快）一边震荡一边逐一滴入 3 mL 70% 冰冷的酒精，（注意观察细胞，不要让细胞发生 aggregate 现象）。5. 置于20冰箱中固定至少一小时。6. 染色前，将细胞从20冰箱取出，300 g 离心 5

33、分钟，去除上清液。7. 以剩余的上清液将细胞打散，加入 5 mL PBS，静置 3 分钟后离心，去除上清液。8. 重复步骤 7，以 5 mL PBS 再清洗细胞一次。9. 加入 1 mL PI / Triton X-100 (Final Conc. P I20 g /mL, Triton-X 100 0.1%,RNase A 0.2mg/ml )，均匀打散细胞，避光染色至少 30 分钟。10.上机前打散细胞并以 35 m 尼龙筛网过滤样本。31 四、List Mode Data 的收集1. 开启合适的 Protocol：利用档案总管（Resource Explorer）直接将你事先设定好的 P

34、rotocol 拖曳到工作区中。2. 此时软件下方的工作清单编写区（Acquisition Manager）中会同时出现一列上样数据（Tube），如下图： 此处提供您下列的信息及设定空间32 a.b.：显示你刚刚拖曳出来的 Protocol 名称，也就是你即将用来收取 List Mode Data 的 Protocol。：在此键入您即将分析的样品的染色名称，你在此设定的染色名称，会在 LMD 储存时一起存到 List Mode Data 中。日后当你分析这个 LMD 时，染色名称就会一并出现在图形的 X 轴和 Y 轴上。c.d.e.：在此键入这个样本所放置的转盘号码和位置，错误的转盘号码和位置

35、会导致样本无法正常上样。：在此键入样本的名称，您在此设定的样本名称，会出现在 List ModeData 档名的最前方，成为 LMD 檔名的一部份，：在此显示的是这管样本即将储存的文件名称，你可以按一下左上角的，进入 Workspace Preferences 中的 LMD File Name 做修改，如下图：在此对话窗口中，你可以依照你的喜好设定 LMD 档案的存盘档名。建议使用者勾选：1. Sample ID 12. Y2K Date (YYYY-MM-DD)3. Tag NumberStart At 001这代表软件会以分析样品的 ID 名称、分析当天的日期以及分析的 是第几 支样品作为

36、 LMD 的檔名。例如：2004 年 3 月 13 日分析的第 1 管Negative control 样品的档名会 是：Negative control 2004-03-13 001.LMD33 3. 利用工作清单编写工具列和上述的工作清单编写区（Acquisition Manager）编写以下的资料：a. 你打算 Run 几支样本：利用 Insert Tube一管一管加入工作清单。b. 每支样本的染色名。c. 你打算储存的 LMD 文件名称。d. 样本转盘的号码、样本管放置的位置。4. 开启仪器操控对话窗口 Cytometer Control：在 Acquisition Limits 中设

37、定收集Data 的时间（Duration）和打算收集的细胞数量（Max. Events），并确定“SetupMode”已取消勾选后，再按一下 Save Protocol。5. 按下仪器操控工具列中的 Start Acquisition ，仪器就会依照你刚刚编辑的工作清单，逐一分析并收取每个样本的 List Mode Data，储存在您专属的 LMD 数据夹中。利用桌面上Protocol的仪器设定条件以工作清单键入的染色名和文件名34 五、Flow Check Run Flow-Check 的意义与目的：Flow-Check 是一种大小一致（10m）的荧光小珠，表面批附一层荧光物质，被雷射激发后

38、，能发出均一且稳定的荧光，跑 Flow-Check 的目的，是用来确认机器的流路是否顺畅，雷射光是否准确的扫瞄到每一颗细胞。当机器稳定时，Flow-Check 被雷射激发出的 FS 读值和每个荧光参数读值的HP X-CV 值必须在 3 以下，而每次所测得 X-mean 值的差异应在+/-5%之间。如下图： Run Flow Check 的时机：a. 每次开机后、Run 样本前。b. 当您怀疑仪器有问题或不稳定时。 Flow Check 的种类：a. 标准的 Flow Check（P/N 6605359）：使用 488 nm 蓝光雷射时，用以评估FS、FL1、FL2、FL3、FL4 等 5 个参

39、数的 HP-CV 值与 Mean 值。b. Flow Check 770（P/N 6607121）：使用 488 nm 蓝光雷射时，用以评估FS 和 FL5 这 2 个参数的 HP-CV 值与 Mean 值。c. Flow Check 675（P/N 6607120）：使用 633 nm 红光雷射时，用以评估FS 和 FL4 这 2 个参数的 HP-CV 值与 Mean 值。35 Run Flow Check：a. 依常规模式进入 Cytomics CXP 软件，开启一个 合适的 Flow CheckProtocol，你可以自己编写一个专门用来 Run Flow Check 的 Protoco

40、l，也可以借用软件内建的 Flow Check Protoco（l 你可以在 Common 的 Protocol数据夹中找到）。b. 依正常模式收取一个 3000 颗细胞的 List Mode Data，开启统计数据栏，记下 FS、FL1、FL2、FL3、FL4、FL5 等参数的 HPX-CV 和 X-mean 值。c. HPX-CV 值应在 3 以下，每次所测得 X-mean 值的差异应在+/-5%之间，以确保机器处于稳定状态。d. 若 HPX-CV 和 X-mean 值不在标准范围内，请进行 Prime 和 Cleanse 的动作后，再重新跑一次 Flow check，若无法改善，请即刻通

41、知 Beckman Coulter公司的工程师。e. 当 Flow check 完成后，即可进行您样本 Data 的收集。36 六、CXP Analysis1. 开启 Windows 2000 后，点选桌面上的启动 CXP Analysis离线软件。2. 选取你专属的数据夹，输入 Password 后，即可进入软件主画面，如下图：主画面与 CXP Cytometer 极为相似，操作方法也雷同，但在 Analysis 中多了数个特殊的图形可供绘制、也增加了批次分析工具列与迭图工具列。批次分析工具列Note：CXP Analysis 和 CXP Cytometer 的数据夹是共享的，也就是你在其中

42、一个软件设立的专属数据夹，也可以在另一个软件中看到。37 单一 List Mode Data 的分析：用鼠标点选档案总管（Resource Explorer）中的 Protocol或 LMD，您能看到在你专属数据夹中所有的的 Protocol 或 List Mode Data。分析单一个 List Mode Data 有两种方法：1. Run Time Protocol analysis：利用“ 收取这个 Data 时所用的 Protocol ”来分析这个 LMD。将档案总管中的 List Mode Data 直接拖曳到空白工作区中即可完成分析，如下图：直接将 LMD 拉到工作区内2. 利用其

43、它的 Protocol来分析：a. 在档案总管中选取您要用来分析 Data 的 Protocol，并将它拖曳至工作区中。b. 再将 List Mode Data 拖曳到这个 Protocol 中，即可完成分析，这时软件变会利用工作区中 Protocol 的设定来分析你拉出来的 LMD，如下图：c. 接着，您可以再拖曳其它的 LMD Data 到这个 Protocol 中，旧的 Data 便会被新的取代。38 先将 Protocol 拉到工作区中，再将 LMD 拉到 Protocol 中d. 点选存取存取工具列中的打印打印，如下图：功能，你可以选择您想要打印的模式进行Print Statisti

44、cs：只印统计数值Print FlowPAGES：打印打印页Note：在分析 Data 时，我们常采用第一种方法分析，但通常我们会对 Protocol 做一些修改，例如：加入打印页（FlowPage），或将 Protocol 修改成能同时分析数个 Data 的模式。建议您将修改过的 Protocol 另外存成一个分析专用的Protocol，以方便日后使用。39 离线荧光补偿调教（LMD Compensation）传统上，荧光补偿值在 Data 收集的同时就必须做妥善的调整，当 List ModeData 储存完成后，若发现荧光补偿不恰当，则必须重新收集 Data。然而 FC 500采用较先进的

45、 FCS 3.0 档案存取模式，储存的 List Mode Data 仍然可在离线状况下利用软件做荧光补偿值的修正。在 CXP Analysis 中进行分析时，若发现 Data 的荧光补偿值需要修正，可点选主要工具列的 Analysis / LMD QuickCOMP，此时工作区内荧光双参数图的 X 轴和 Y 轴上会出现调整荧光补偿值的滚动条，同时会出现一个 Compensation Matrix的对话窗口，针对需要调整荧光补偿值的参数，拉动适当的滚动条，就可进行离线荧光补偿调教：未做荧光补偿调整40 绘制等高线图（Contour Plot）、密度图（Density Plot）、岛屿图（Sur

46、face Plot）、透试图（Tomogram）CXP Analysis 中增加多种在 CXP Cytometer 中无法绘制的图形，您可以利用绘图工具列简单地绘制这些图形：等高线图 Contour Plot密度图 Density Plot岛屿图 Surface Plot透视图 Tomogram41 编写打印页（FlowPAGE）:在 CXP 这个软件中进行打印时，图形（Plots）和统计数值（Statistics）是被分开来打印的。使用者若想要让统计数值伴随着图形来打印，则需要编写一个打印页（FlowPAGE）。打印页（FlowPAGE）好比一张 A4 的打印纸，我们可以在 Protocol

47、 中预先编写排版好的打印页。当需要打印时，您只要打印这张打印页，便可以得到您想要的排版模式。1. 点选打印页工具列中的 New flowpage，您会得到一个空白的打印页。点选您想要放在打印页中的图形，直接将它拖曳到打印页中，这个图形就会出现在打印页中，如下图：42 2. 利用打印页工具列，您可以在打印页中插入文字、图片，并将分析图形加以排版，成为您想要的样子。注意：打印页上的图形和工作区中的图形是同步的，所以当您拖曳一个新的 LMD Data 到工作区时，打印页中的图形也会随之更新。3. 按下存取工具列中的 Save Protocol，您编写的打印页便会储存成 为Protocol 的一部份，

48、当您下次再将这个 Protocol 叫出时，这个打印页会同时出现在工作区中。4. 此外，您可以进一步将打印页转存为我们常用的 PDF 档案格式：点选主要工具列中 Files / Print to PDF f，il便e可以将 FlowPAGE 储存成为 PDF 文件形式。43 多档案分析有时候我们会同时将数个 LMD Data 放在同一个 Protocol 中分析比较，这时我们必须将原来只能分析一个 LMD Data 的 Protocol 修改成同时能分析数个 LMD 的Protocol。在此我们以建立一个能同时分析 4 个档案的 Protocol 为例子，作为说明：1. 将只能分析一个 LMD

49、 Data 的 Protocol 拖曳至工作区。2. 拖曳第一个要分析的 LMD Data 到这个 Protocol 中。3. 点选 FL1/FL2 的双参数图形，选择 Plot / Duplicate Plot，此时会复制一个和 FL1/FL2 完全相同的双参数图形，利用鼠标直接将原来双参数图形中的十字线区域拖曳至新的双参数图形中，复制位置完全相同的十字线区域，但软件会自动将您新的区域附上新的名字。如下图：4. 按着键盘上的 Ctrl 键不放，同时利用鼠标将第二个要分析的 LMD Data 拖曳至上一步骤中复制出来的双参数图形中，这时我们会在新的双参数图形中看到第二个 LMD Data 的分

50、析结果。44 5. 重复步骤 35，您便可以在一个 Protocol 中，同时看到四个不同档案分析的结果，如下图：45 6. 点选 File / Save Protocol A s，将这个修改过的 Protocol 另存新档，现在这个 Protocol 便能用来同时分析 4 个 LMD Data。Note：因为进行多档案分析的 Protocol无法再用来收取 Data，我们通常将这样多档案分析专的 Protocol 存在（Analysis）这个数据夹用 Protocol中以资区别。7. 重新开启这个 Protocol，这时您可以直接（不需再按 Ctrl 键）将您要分析的 4 个 LMD Dat

51、a 分别拖曳到各个 Color Dot Plot 中。如下图：46 迭图（Overlay Plot）细胞在处理 前和处理后的荧光 变化，我们 常以迭图的 方式表现。在 CXPAnalysis 软件中，有三种方法可绘制迭图：1. 冻结法a. 在工作区中，先开启一个 List Mode Data。b. 进入直方图的修改对话窗口，在 Histogram 选项下方勾选冻结选项，冻结这个直方图，如下图：在此图中按鼠标右键，点选 Format 进入修改窗口。在 Histogram 选项中，将冻结选项勾起，以冻结这个图形。c. 从档案总管中拖曳另一个档案到这个 Protocol 中，即可完成这两个档案的迭图

52、，如下图：Note：冻结法操作容易，但最多只可同时重迭三个档案。d. 可重复上述方法，进行第二个档案的冻结。47 2. 在多档案分析的 Protocol 中绘制迭图a. 编写一个多档案分析的 Protocol。b. 点选绘图工具列中的 Overlay plot，此时会在软件工作区中出现一个空白的迭图，利用鼠标直接将想要重迭的单参数图（*.HST）直接拖曳至这个空白的迭图中，如下图：c. 点选迭图工具列中的 Overlay mode即可完成迭图，如下图：你可以进一步利用迭图工具列中的工具，插入统计数值、或说明文字来修饰这个迭图。48 3. 将要重迭的单参数图（Histogram）另外存档，再进行迭图a. 依正常方式分析第一个 List Mode Data。b. 点选打算进行迭图的单参数图后，点选File / Save Histogram File A，s将这个直方图单独以 Hst 档案格式储存到 HST 的数据夹中，如下图：将这个直方图以 Hst 档案模式存在 HST 这个数据夹中c. 重复上述步骤，将要重迭的单参数图都存在 HST 数据夹中。d. 在任何一个 Protocol 中点选点选绘图工具列中的 Overlay plot，开启一个空白的迭图，利用鼠标将你刚刚存在 HST 数据夹中的 Hst 档案拖曳到这个空白的迭图中，即可得到如