MSC细胞免疫组化的全过程

1、细胞免疫组化全过程细胞免疫组化的材料：盖玻片：18xl8mm2,20 x20mm2；6孑L板（NUNK）,90mm培养皿。载玻片重铬酸钾，浓硫酸，超纯水，无水酒精，多聚甲醛，多聚赖氨酸（武汉博仕德，sigma）,弯枕头lml注射器，消毒的纱布条0.01MPBS液。0.3-0.5%TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚）,DPBS,0.3%也02,5%二抗血清，一抗，荧光标记二抗，DAB显色试剂盒，湿盒，明胶，苏木素。Hoechst33342（碧云天，10mg,C1022）,5%BSA封闭液试剂配制：1，酸液：重铬酸钾：水：浓硫酸=1：2：8；2，0.01%多聚赖氨酸：根据说明书，用塑料器皿

2、进行稀释，过滤除菌分装到离心管中。封口膜封闭，4度保存。利用无菌去离子水稀释，0.3mlPLL+3ml无菌去离子水，混匀放入5ml离心管中，封口密封4度存放。3，4%多聚甲醛先配好0.1M的PB1000ml（磷酸二氢钠2.96g,磷酸氢二钠28.7g,加双蒸水至1000ml）然后.称取40g多聚甲醛,放如广口瓶中，加入适量的0.1M的PB，摇晃后放入烘烤箱中，用微火加热60C两分钟，然后拿出摇匀，如没有熔化，再放加热两分钟，直到融化为止。（瓶子一定要用牛皮纸包好，不然很难闻。一定要用温火，不要煮沸了。）.冷却后用滤纸过滤，最后用0.1M的PB定容至1000ml,既为4%的多聚甲醛。（或者，在1

3、000mlPBS中加入多聚甲醛粉末40g，磁力搅拌器上加热搅拌，完全溶解后，普通滤纸过滤，4C保存）4，0.01MPBS:8gNacl,0.2gkcl,1.44gNa2HPO4,0.24gKH2PO4,1L超纯水244,5，无钙镁离子的DPBS:0.2gKCL,0.2gKH2PO4,8.0gNacl,1.15gNaHPO4.6，30%TritonX-100储备液：TritonX-10028.2ml+0.1mol/Lpbs（ph7.3）72.8ml将这两种液体混合后置入37-40C水浴中2-3h，使其充分溶解混匀。然后置入到4C储存。使用前用PBS稀释到所需的浓度0.3-0.5%。使用目的因为它

4、能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。（由于检测的是膜抗原在胞浆内表达，因此不用或者用0.01%tritonx-100）7，0.3%H2O2配制：纯甲醇10ml+30%H2O20.1ml,充分混匀即可，使其最终浓度为0.3%。现用现配，4C保存。（做酶免疫组化用，细胞免疫组化一般不用）8，细胞培养液：10%FBS-L-DMEM+100微克/ml青霉素钠+100微克/ml硫酸链霉素。9，细胞冲洗液：0.01MPBS+500微克/ml青霉素钠+500微克/ml硫酸链霉素10，0.5mol/lPH9.5碳酸氢盐缓冲液（CB:称取NaHCO33.7g,Na2CO30.6g加蒸馏水至100ml.溶解后

5、调PH11，50%缓冲甘油：1份纯甘油加1份CB.12，hoechest33342：用0.01MPBS稀释到0.5-10“g/ml工作浓度。13,DAB显色试剂盒：A,B,D三种染液使用（详见说明书）14，苏木素染色15,抗体选择：一抗：鼠抗CD45,CD105,CD90,二抗羊抗鼠IG。抗体原液分装每管20微升，以1:200;1:300;1：400比例进行摸索最佳比例。使用前必须要离心。16,5%BSA封闭液：称取5gBSA用0.01MPBS稀释。配制时不可剧烈震荡，否则会产生泡沫，先在离心管中加入适量的PBS后，然后加入BSA少量，稍溶解再加入余下的BSA，然后平转BSA离心管，用手握住3

6、-5Min，静置15min,即可溶解。17，抗体稀释液:配制成1%或3%BSA-PBS溶液。18，抗荧光猝灭剂。使用之前要进行预温到室温19，指甲油，盖玻片的处理1，爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。将剪裁好的爬片，置于浓硫酸重铬酸钾液（重铬酸钾：浓硫酸：水=1：2：8）中

7、浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。高压后取出放入烤箱中烤干，备用。或烤干后可放入超净台中风干。，细胞爬片1，室温将常规处理的盖玻片铺于培养皿中，用移液枪将0.01%多聚赖氨酸滴加到玻片上，室温作用lOmin后，用消毒好的纱布条吸去玻片上的多聚赖氨酸工作液，然后在超净工作台内晾干次日使用。对于细胞生长状态良好染色时不掉片的可以不用防脱片剂处理。2，.第二天加细胞前，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是

8、使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作，此过程一定要注意防止产生气泡。3，然后，进行细胞消化处理，稀释成1x104/ml接种到六孔板里（或者按2x104/ml接种到9Omm培养皿中）。按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。未取出的可接着继续培养。，爬片固定及封闭1，将取出的细胞爬片放入

9、到玻璃小皿中进行浸洗，如果进行冲洗，也应将PBS滴入到玻片上作用2min,再让PBS自上而下流下来，一旦组织有飘起更要小心。这样冲洗3次，各两分钟。2，将冲洗后的爬片放入含有4%多聚甲醛（无水乙醇90ml+40%甲醛10m1）的玻璃皿中，在4C冰箱中固定20-30min.（然后在空气中干燥5min）3，将固定后的细胞爬片用37CPBS清洗3次各2min,（清洗方法同上）4，用0.3%-0.5%Tritonx-100（DPBS配制）孵育1次20min,然后用PBS清洗3次每次3min.（此步可以省去）5，用0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下作用10-15min.此时应该准备湿盒里面放些

10、水。然后放几张载玻片做好标记，将经过通透及过氧化物酶封闭后的爬片，用钩子从6孔板或玻璃皿中勾起。此步骤主要应用于酶底物免疫组化，对于荧光免疫组化可以舍去。6，用PBS清洗标本3x3min.然后用滤纸将爬片四周擦干（距离边缘约1-2mm），然后用组化笔在擦干的区域迅速画圈，将爬片放在干燥的载玻片上（注意正反面），滤纸吸干四周时一定只可吸距离边缘l-2mm,不可触及细胞并不可让片子干燥。7,用5%二抗来源的正常血清DPBS液滴入到细胞爬片上（对于8mmx8mm玻片，以每片加入50微升，在湿盒中室温下（37C）封闭爬片作用20min（10-15min）,然后倾去血清，甩去或者吸弃或者用滤纸吸掉血清不

11、可清洗。三,洗涤及染色处理（一）Hochest细胞核染色及荧光观察：将已经封闭处理的细胞吸去或甩去多余的液体,然后用毛细滴管吸取经适当稀释的特异性抗体CD45,CD105,CD90的一抗，加到盖玻片上，放于湿盒中4C冰箱过夜，拿出后在37C条件下复温45min,将复温后的一抗玻片，用吸管吸去抗体液，然后用PBS洗涤3x5min.3，将洗涤后的盖玻片放到盛有载玻片的湿盒上，加入带有荧光CY3（FITC）标记的稀释后的二抗，避光放置到湿盒中，然后将湿盒放置到恒温箱中孵育lh,然后用PBS洗涤3x5min,接着用配制好的Hoechest33342避光染色细胞核，5min,然后用PBS冲洗3次。最后用

12、50%缓冲（0.5mol/l碳酸盐缓冲液ph9.0-9.5）甘油封固，或者用抗荧光淬灭剂进行封固，之后用指甲油封闭处理。荧光显微镜观察。（二）DAB显色及苏木素复染观察1，甩去血清后，直接加入稀释好的一抗，然后放入湿盒中（室温作用1小时），然后4C过夜（至少16-24h）,从冰箱中取出后在37C复温45min-60min,加入一抗血清的同时，最好用DPBS液作为阴性对照实验复温后将爬片从载玻片上取下2,吸去一抗用PBS洗3次x5min，滤纸吸湿并置于擦干的载玻片上，然后避光加入已稀释好的生物素的二抗后放入湿盒中，在37C恒温箱中30min,然后用PBS清洗标本洗3x5min.3，DAB显色处理

13、（快速加入），在避光条件下在油镜下观察颜色，当观察标本出现棕色时（约3-10min），立即倒掉然染液.（DAB配制好的工作液在30min内有效，并且要避光存放）4，在含有六孔板或玻璃皿中进行浸洗1次5min.终止染色。5,然后苏木素复染10min,自来水洗涤5min6，树胶封片（直接在载玻片组织上滴加一滴3%明胶封片液（称取明胶3g,加水40ml,然后加热至60C，使明胶完全熔解，然后再加入60ml甘油，趁热用滤纸过滤，封片时事先加热明胶，使其融化），然后将盖玻片有细胞的面朝向下朝向载玻片，一手拿住盖玻片某一拐角，另一手拿对面拐角，接近封片液锦缎的拐角先降低，直接接触到液体时为止，当发现液体接

14、触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，避免产生气泡）注意事项：1，用过氧化氢进行孵育时间不可过长时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4C避光保存。由于传统的ABC法和SP法,免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素进行灭活。灭活内源性POD一般用3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般1030min；2，血清封闭的目的是组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BS

15、A、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度。固定的目的是：防止标本从玻片上脱落。除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛。在固定爬片时，如果用4%多聚甲醛则要固定15min,然后再用37C去离子水将甲醛冲干净，注意要轻柔，要不然掉片很厉害，在操作过程中注意玻片的正反面,可以在切割玻片的时候,在玻片的右上角弄个缺口,这样使用的时候就不会弄反了。细胞片的质量对实验成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起看,这一步关键的是玻片的处理以及细胞的活力。因为免疫荧光中需要用到荧光抗体,因此必

16、须记住避光操作。此外抗体浓度的选择可能更加重要,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4C或-20C避光保存，以免因标记蛋白竭力或荧光减弱而影响结果。在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4C最佳，反应温和，但时间最好超过1624h。8，为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合

17、的物质。PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。9，为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不

18、会产生气泡。10，有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。11,chemicon公司的一抗一般100微升，价格2800元效果较好。12，一抗4度孵育后为何要进行37摄氏度复温：首先为了防止切片从4度直接放入PBS易脱片，其次，使抗原抗体结合更加稳定，一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用。4度和37度时，分子运动方式不同，前者分子碰撞几率和运动速度小于后者，后者结合过呢赶快，但敏感性也提高了并易引起非特异性染色。13，使用0.3%过氧化氢一般作用10-30min,用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引

19、起脱片.现用现配，配好后4度避光保存。14,PBS清洗方式选择，次数及时间选择：单独冲洗，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会；温柔冲洗，防止切片的脱落，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS,持续2分钟左右就完全足够了。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱

20、，都将影响染色的结果。H即理根虹肖匸检亡旷篇色心粧化现躲职I州1+Hifii-存戒拓理冲滋戌9A%；车哉纶过念血滋酣（欧竝松扛飙施此血抵利缽尊门彳务相蚩善于ri寿此边碌小心底,2-授喙TOC o 1-5 h z，。將M帝前于我寿出卫癘-:朮:_J-型灌玉u阴$灌况凶！.誇製，亠殆;黃”二_A!LJbJ.2）朋播*一.畀仇人沐押皿虧乖祈務兎緬松次（菽魏I.电虫我蓟轡4包桶恳的）亠.：|号”底灵甘呼笳，阶八3国屈龜|瘵怎囤辽比沁t_.I4咂玄因免很鬼如3誌科2込社_IWi*iH）梵启良施M南r二篮訶冋痕了m莎仙|小曲丄才躍鸥aI谯噱1%弓Qee（滋才彳谱&產p琏理知M1總為怙磯耳巾灣I盅也5翩啜1

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