基因工程学原理内蒙古大学

1、第七章 克隆基因的表达邢万金内蒙古大学生命科学学院二、克隆基因的表达外源基因mRNARNAPol载体外源基因大肠杆菌一、基因克隆第一节 外源基因在原核细胞中的表达1. 真核生物的基因用cDNA2. 不能直接用真核基因组DNA（带有内含子）3. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害4. 有Shine-Dalgarno（S-D）序列一、原核表达真核基因的注意事项是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。二、原核生物基因表达的调控元件1. 启动子-35 Box 和

2、 -10 Box（1） 启动子序列 原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子大肠杆菌启动子的一致序列ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTCCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAATTTATTCCATGTCACACTTTTCGCATCTTTGTTATGCTATGGTTATTTGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACGCCGTGATTATAGACACTTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCAAATGA

3、GCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCCAAAACGTGTTTTTTGTTGTTAATTCGGTGTAGACTTGTAAACCTACATAATCGACTTGTAAACCAAATTGAAAAGATTTAGGTTTACAAGTCTACAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTCAAAAAAATACTTGTGCAAAAAATTGGGATCCCTATAATGCGCCTCCGTCAATTTTTCTATTGCGGCCTGCGGAGAACTCCCTATAATGCGCCTCCATAAAATAAATGCT

4、TGACTCTGTAGCGGGAAGGCGTATTATGCACACCCCG-35 region -10 regionlaclacIgalP2araBADaraCtrpbioAbioBtRNAtyrrrnD1rrnE1rrnA1一致序列T C T T G A C A T.11-15bp.T A T A A T.5-8bp.A5142 38 82 84 79 64 53 45 41 79 95 44 59 51 96 C55 T48 G42转录起始位点5-TTGACA-35-TATAAT-32）-10 box（Pribnow Box）TTGACATATAAT转录起始位点17 bp5核糖体结合位点R

5、NA聚合酶 s亚基的识别位点 。1）-35 box （Sextama box）原核启动子共有序列的功能Sextama-35Pribnow-10XXXX TTGACA XXXXXXXXXXXXXXXXX TATXXXX AACTGT XXXXXXXXXXXXXXXXX ATAAAT XXXXXXX XXTTA XXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXAGTC16 -19bp5-9bpInitiation2. 翻译的起始位点（1）核糖体结合位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） 序列：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。S-D序列距离AUG的距离也影响翻译核糖体小亚基1

6、6S rRNA 35UCCUCCASD 序列mRNA 5AGGAGGUAUG位于SD序列后，目的基因前。2）转录终止子3）起始密码在表达载体克隆位点的下游所设计一段转录终止序列。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃。4）终止密码5）翻译增强子Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。（1）强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋

7、白的10%-30%以上。（2）低水平的基础转录不诱导时很少表达。（3）应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。1. 最佳启动子必须具备的条件三、基因工程常用的原核启动子2. 基因工程常用的原核生物启动子（1） 乳糖启动子lac1）来源可用乳糖或其类似物IPTG诱导。lacPlacO目的基因lac Zlac Ylac Alac Plac Olac I结构基因来自于大肠杆菌的乳糖操纵子：2）结构CAP结合区RNA聚合酶结合区阻遏物结合区核糖体结合区（包含lacZ的前8个密码）HaeIII片断（ “可移动的lac启动子小片断”）。HaeIIIHaeIIICAP结合区RNA聚合酶结合区阻遏物结合区核糖体结

8、合区203 bp（2）色氨酸启动子 trptrpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2启动子；O操纵基因；衰减子来自大肠杆菌色氨酸操纵子:P1O目的基因（3）PL和PR启动子1）来源cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcIIN:抗终止蛋白；Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；P:启动子；O:操纵子。R:右；L:左PL/OLOR/PR目的基因目的基因噬菌体的启动子(比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高):阻遏物转录转录当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑

9、制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期。cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcII早期左边转录早期右边转录3）调节基因用cI85742oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857PL外源基因28oC时阻遏PL，外源基因不转录。是一个温度敏感性的突变基因：2）表达载体常用噬菌体启动子PL（4）大肠杆菌表达常用的启动子启动子（来源）调节作用诱导作用Lac (E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；温度Trp (E. coli)色氨酸饥饿，吲哚丙烯酸Lpp (E. coli)IPTG，乳糖phoA (E. coli)phoB(正)；phoR(负)磷酸饥饿

10、recA (E. coli)lexA萘啶酮酸araBAD (E. coli)AraCL阿拉伯糖proU (E. coli)渗透性Cst-1 (E. coli)葡萄糖饥饿tetA(E. coli)四环素cadA(E. coli)cadRpHnar(E. coli)fnr厌氧环境，硝酸盐离子Tac(杂）(E. coli)lacI, lacIQIPTGTrc(杂)(E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；温度启动子（来源）调节作用诱导作用Lpp-lac (E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；温度Psyn (E. coli)lacI, lac

11、IQIPTGPLtet0-1(E. coli)无水四环素Plac-ara-1 (E. coli)IPTG，阿拉伯糖PL (噬菌体)lacIts857温度PL-9G-50 (噬菌体)温度cspA (E. coli)温度PR-PL (噬菌体)lacIts857温度T7(T7噬菌体)级联系统IPTGT7-lac(T7,E. coli)lacIQIPTGPL-T7(,T7)lacIts857; lacIQ温度;IPTGT3-lac(T3)lacIQIPTGT5-lac(T5)lacI, lacIQ; IPTGT4基因32(T4)T4感染nprM-laclacIQIPTGVHb(vitreoscilla

12、)氧气，cAMP-CAP四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1. 细胞质中表达（1）包涵体（inclusion body）细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。1）组成成分2）形成原因重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等。 表达量过高。 含硫氨基酸多。 温度高或胞内pH接近蛋白的等电点。 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白。3）包涵体表达的优点重组蛋白易于分

13、离、免受细菌蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。4）缺点5）减少包涵体形成的策略 降低重组菌的生长温度。 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。 供给丰富的培养基，最佳培养条件，如氧、pH等。 2. 周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。（2）周质表达的优点一般位于N端，为15-30 aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。 碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶切割位点外源蛋白（3）信号肽（signal peptide

14、）phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 大肠杆菌的信号肽：1）常用的原核信号肽 胡萝卜欧氏杆菌PelB蛋白。 金黄色葡萄球菌的蛋白A。 枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶（endoglucanase）。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。溶血素（hemolysin）、使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3. 胞外表达细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)。（1）策略与大肠杆菌细胞的分泌蛋白融合表达。（2）优点1

15、）蛋白质受酶解作用最少2）蛋白质容易纯化（胞外蛋白种类很少）（3）缺点1）外源真核蛋白一般不会被分泌到胞外2）分泌的量很稀。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG -外源基因- TAA（1）优点五、几种类型的原核表达载体1. 非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。（2）缺点容易被宿主蛋白酶破坏、或形成包涵体。哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。（1）pKK223-3 载体1）组成结构： 强启动子: tac（trp-lac）:trp的-35区lacUV5的-10区lacO操纵基因操纵基因：终止子：调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操

16、纵子调节基因Lac I。rrnB的强终止子S-D插入位点区S-D序列和插入位点区：载体的其余部分：来自pBR322质粒。2）表达诱导tac PLac OS-D插入位点区rrnB T宿主lac IIPTG阻遏物IPTGRNA聚合酶EcoRISmaIBamHISalIPstIHindIIIPKK223-34586 bpamprrrnBSDlacOtacPtetroriEcoRISmaIBamHISalIPstIHindIII与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pIN III系列 2. 分泌型表达载体pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-

17、comA3,（1）组成结构Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。调节基因：lac IS-D序列和ATG。大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（多克隆位点）。 强启动子：分泌信号肽：EcoRI , HindIII, BamHIpIN III-comA17.4 kpamprIPPlacPlacOSDompaorilacIEcoRI HindIIIBamHI外源基因产物蛋白与载体上的菌体蛋白连接在一起。1）启动子：tac2）操纵基因：lacP3）调节基因：lacI4）S-D序列5）ori：pBR322 ori6）GST(谷胱甘肽S

18、转移酶）3. 融合蛋白表达载体系统-pGEX系列（1）优点（2）组成结构便于分离和纯化。便于溶解pGEXlacItaclacPlacOSDGSToriamprMCS（3）产物分离用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化，凝血酶或Xa因子把外源蛋白从GST上切下来。columnGST凝血酶可再利用目的蛋白洗脱再利用收集（4）几种pGEX的多克隆位点1）pGEX-1TEcoRIBamHI凝血酶Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp *CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC

19、GTG ACT GAC TGA CGAGST2）pGEX-2XSmaIEcoRIBamHI凝血酶Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp *CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGA CGAGST3）pGEX-3X Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser *ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG ACTEcoRIBamHISmaIXa因子（5）其他融合蛋白系统1）His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。如pET-his等。pET-his2.9 kb