外源性bFGF对鸡形觉剥夺性近视眼球后壁组织中VIP表达的影响

1、外源性bFGF对鸡形觉剥夺性近视眼球后壁组织中VIP表达的影响【摘要】目的:观察外源性bFGFbasifibrblastgrthfatr对雏鸡形觉剥夺性近视眼frdeprivatinypia,FD眼球后壁组织血管活性肠肽vasativeintestinalpeptide,VIP表达的影响。方法:将出生2d龄的40只来亨雏鸡随机分为对照组和实验组，两组右眼为遮盖眼，左眼为自身对照眼。对照组遮盖眼注射1g/L牛血清白蛋白bvinesrualbuin,BSA溶液20L，共10只鸡；实验组遮盖眼玻璃体腔注射bFGF1，2，4ng+1g/LBSA溶液20L，每种剂量10只鸡。1k后采用SP法免疫组织化学

2、染色和逆转录聚合酶链反响检测眼球后壁组织VIP的表达。所有实验数据，对照组和实验组比拟采用单因素方差分析，不同浓度实验组间采用SNK-q检验。结果:VIP的表达主要位于视网膜光感受器外节、内核层、内丛状层和脉络膜，在神经节细胞层和神经纤维层有较弱表达。所有组自身对照眼的VIP表达两两比拟均无明显差异P0.05；实验组与对照组遮盖眼相比拟差异有统计学意义，VIP表达在实验组明显上调P0.01)，并且VIP的表达在实验组组间的差异有统计学意义，随药物剂量增加有逐渐上调的趋势P0.05。结论:外源性bFGF可上调鸡FD眼球后壁组织VIP的表达。【关键词】碱性成纤维细胞生长因子血管活性肠肽形觉剥夺眼外

3、源性TheeffetfexgenusbFGFntheexpressinfvasativeintestinalpeptideinfrdeprivatinypiafhikAbstratAI:Tinvestigatetheexgenusbasifibrblastgrthfatr(bFGF)asaregulatrntheexpressinfvasativeintestinalpeptide(VIP)nfrdeprivatinypia(FD)fhikretinal-hrids-slera.ETHDS:Frtyt-day-ldlehrnhikenseredividedrandlyintntrlgrupan

4、dexperientalgrup.Therighteyesfthehikensereveredandthelefteyesservedastheautntrleyes.TheveredeyesfthentrlgrupreEived20L1g/Lbvinesrualbuin(BSA),10hikensaggregated.TheveredeyesftheexperientalgrupreeivedbFGF(1,2,4ng)+20L1g/LBSA,itheahdsagen10hikens.Theeyesinthetgrupserentinuallyveredfr1eek.Theexpressinf

5、VIPnretinal-hrids-sleraasinvestigatebystreptavidin-perxidase(SP)iunhistheistrystainingandreversetransriptin-plyerasehainreatin(RT-PR).Thedataereanalyzedbyanalysisfvariane(ANVA)beteenthentrlgrupandexperientalgrupandbyanalysisfSNK-qangeahdsageintheexperientalgrup.RESULTS:VIPidespreadexpressinexistednp

6、htreeptr-uter,innernulearlayer,innerplexifrlayerfretinalandhrids;eakexpressinexistednganglinelllayerandnervefiberlayer.TheexpressinfRNAfVIPinautntrleyesbeteengrupsasntstatistiallysignifiant(P0.05).Inparisniththeveredeyesfntrlgrup,theexpressinfRNAfVIPinexperientalgruperesignifiantup-regulated(P0.01),

7、shingadse-dependentanner(P0.05).NLUSIN:ExgenusbFGFuldup-regulatetheexpressinfVIPnretinal-hrids-slerahihayplayanantagnistiatininularenlargeentfhikenFD.KEYRDS:basifibrblastgrthfatr;vasativeintestinalpeptide;frdeprivatinypia;exgenusLiuSZ,JiangJJ,angH.TheeffetfexgenusbFGFntheexpressinfvasativeintestinal

8、peptideinfrdeprivatinypiafhik.IntJphthall(GujiYankeZazhi),2022;7(2):406-4080引言近视的发病机制复杂，因此制约了近视眼的病因学治疗。近年来通过对实验性近视的研究发现眼内生物活性物质对眼球的生长起重要的调控作用，其中细胞因子、神经递质、激素、视黄酸都证实与近视的发生、开展有亲密的关系。但是随着越来越多近视信使的发现与研究，也提醒了近视的发病机制不是一个简单的单通路信号传导过程，而是一个多种近视信使介导的多通路信号传导过程，诸多因素间存在着复杂的网络调控机制，因此深化理解各种近视信使之间的互相作用，是否存在协同或抑制作用，将

9、有助于说明近视的发病机制，并找到有效的治疗手段。碱性成纤维细胞因子basifibrblastgrthfatr,bFGF和血管活性肠肽vasativeintestinalpeptide,VIP分属不同类型的近视信使，我们通过外源性bFGF来观察其对鸡形觉剥夺性近视眼球后壁组织中VIP表达的影响。1材料和方法1.1材料安康2d来亨雏鸡湖南农业科学研究院畜牧研究所原种鸡场提供，雌雄兼用，在购置当日，40只雏鸡右眼均使用10L塑料试管底制成的眼罩遮盖，左眼为未遮盖眼，作为自身对照眼。在12h12h的昼夜节律下进展普通饲养，饲养的动物室通风，室温保持在2832,水和食物随意。分别向遮盖眼玻璃体腔注射药物

10、20L，均以牛血清白蛋白bvinesrualbuin,BSA作为载体，BSA浓度为1g/L。随机将这40只雏鸡分为对照组玻璃体腔注射1g/LBSA溶液20L和3种剂量梯度的bFGF实验组玻璃体腔注射bFGF1，2，4ng+1g/LBSA溶液20L。bFGF(美国Prteh公司)，BSA(美国Siga公司，兔抗人VIP多克隆抗体工作液及SP-9001免疫组化试剂盒美国ZYED公司，trizl、逆转录试剂盒、PR试剂盒美国Ferentas公司。1.2方法雏鸡饲养1k后，摘去眼罩，在深麻醉的状态下断颈，无菌快速摘除双侧眼球，将眼球沿赤道部切开，去除玻璃体，取眼球后壁组织切开一半放入标记好的EP管中，

11、于液氮中速冻10s，然后转入-70深低温冰箱中保存。剩下一半眼球后壁组织投入盛有40g/L多聚甲醛溶液的小瓶中4固定2448h，瓶身贴上胶纸标记，石蜡包埋存放，使用时做5厚连续切片。免疫组化步骤按ZYED公司SP法操作，以PBS代替一抗做阴性对照，胞质出现棕黄色颗粒状沉积为VIP阳性表达。另以Trizl常规提取RNA，用DU-70紫外分光光度计测量RNA质量和浓度，A260/280比值为1.82.0。以10g/L甲醛变性凝胶电泳三条带显示明晰来证实RNA完好。逆转录获得DNA。以DNA为模板，PR扩增VIP的目的基因。按照美国生物信息中心NBI提供的基因库GenBank中查找雏鸡VIP的序列序

12、列号：N205366设计PR扩增引物，使用Prier5软件设计。VIP引物：senseprier5-tagaaatgaaggatgtg-3,anti-sense5-tttgaaagggtgtagtt-3，片段长177bp；-atin引物：senseprier5attttgtgaagta3，anti-sense5atatgtttgagattaaa3，片段长310bp。反响条件为：逆转录，42温育60in，94变性5in。PR反响条件为：94变性1in，55退火45s，72延伸45s，共30个循环，最后先于7210in，再于4保存。反响产物5L加2.5L载样缓冲液，在2TBE电泳缓冲液中以15g/

13、L琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后摄像，用EagleEye图像处理系统进展分析，VIPRNA的相对含量用VIP与-atin光密度的比值表示。统计学处理：结果均以表示，数据采用SPSS11.5软件进展分析，对照组和实验组比拟采用单因素方差分析，不同浓度实验组间采用SNK-q检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1眼球后壁组织VIP的表达对照组和实验组的遮盖眼及自身对照眼的眼球后壁组织均有VIP阳性表达，主要位于视网膜光感受器外节、内核层、内丛状层和脉络膜，可见胞质呈棕褐染色，在神经节细胞层和神经纤维层有较弱表达，胞质呈淡黄着色图1。2.2眼球后壁组织VIP的RNA表达雏鸡眼球后壁组织的VIPR

14、NA经RT-PR后产生一条177bp的电泳条带，内对照-atin产生一条310bp电泳条带，对照组和实验组眼球后壁组织均有VIPRNA表达；与对照组比拟，实验组VIPRNA表达明显上调P0.01；VIP的表达在实验组组间的差异有统计学意义，并且随药物剂量增加有逐渐上调的趋势P0.05；所有组自身对照眼的VIPRNA表达两两比拟均无明显差异P0.05,图2，表1。3讨论VIP是由28个氨基酸残基组成的多肽，在眼内有广泛分布，结膜、小梁网、虹膜、脉络膜、巩膜、视网膜都有VIP表达，葡萄膜存在大量VIP神经纤维，即虹膜、睫状体、睫状突、视网膜及脉络膜都存在VIP神经纤维1。有学者认为VIP作为一种重

15、要的近视信使可能在视网膜程度对近视眼后部巩膜主动重塑起重要的调控作用2。bFGF属于多功能成纤维细胞生长因子家族，作为近视信使的一种，有很多研究都说明采用结膜下或玻璃体腔注射外源性bFGF可显著抑制FD所导致的眼轴延长3,4。Rhrer等5对bFGF高亲和力和低亲和力受体的定位发现，通过自分泌或旁分泌，几乎所用的视网膜细胞都有bFGF和其高亲和力受体表达。在突触层内从状层和外从状层，有高、低亲和力受体的共同结合位点，信号传导需通过高、低亲和力受体及bFGF组成的三重复合体，这种共同性结合位点位于较窄的突触层面正是高亲和力受体功能维持的基矗在视网膜中VIP通过无长突细胞分泌，因此在内丛状层有丰富

16、的VIP能无长突细胞突触分布，然而这个部位也正是高、低亲和力受体共同结合位点丰富的层面，bFGF可能通过影响生长调节通路无长突细胞的突触传递活性及效率来调控多种神经递质，也可被这些细胞所调控，这种共同的作用可能影响着眼球的生长。本研究就是以bFGF对FD眼中VIP表达的影响作为切入点，讨论bFGF和VIP这两种近视信使可能存在互相作用。我们发现，VIP在光感受器外节有较强表达，这一表达部位与一氧化氮合酶iNS在视网膜外层的表达部位相似6，通常表达VIP受体的细胞90显示有神经源性iNS的定位7。bFGF可诱导视网膜色素上皮细胞生成iNS，通过对一氧化氮生成的调节，局部参与光感图2眼球后壁组织V

17、IPPR产物15g/L琼脂糖凝胶电泳图1：自身对照眼；2：对照组遮盖眼；35:实验组1,2,4ng遮盖眼受器的信号转换8。根据研究结果，外源性bFGF可能诱导iNS生成，通过一氧化氮生成影响VIP受体活性，从而调节VIP的表达，参与光感受器的信号转换，当然这种推测还有待进一步证实，但是由于光感受器外节是近视信使作用的重要部位，因此这种推测也存在局部理论基矗由于视网膜中VIP通过无长突细胞分泌，所以在无长突细胞分布的内核层和内丛状层会出现较强VIP表达，这与我们的实验结果吻合。由于视网膜VIP的表达依赖于光条件，在FD大白鼠中可发现，FD50d后，VIP细胞数大约减少30，回到正常视觉环境，VI

18、P免疫活性可完全恢复9；在亮环境喂养的鼠，VIP表达可上调，而在暗环境喂养的鼠，几乎无法检测到VIP10。本实验中由于未遮盖眼承受了正常光的刺激，所以VIPRNA表达会比对照组要高。承受bFGF玻璃体腔注射的FD眼VIP表达虽然较未遮盖眼要低，但是随着剂量的加大，VIP表达上调，这种作用存在剂量依赖性，在高剂量组可发现VIP表达与未遮盖眼相比已没有差异，bFGF可拮抗FD对VIP免疫活性的抑制，这种现象可能的解释为大量的外源性bFGF进入玻璃体内，通过扩散作用，到达视网膜，与所有位于内丛状层的高亲和力受体结合，组成高、低亲和力及bFGF三重复合体，复合体可通过与VIP能无长突细胞突触进展信号传

19、导，对VIP的分泌正性上调，VIP生成增加。VIP上调可能影响视网膜内层信息传递回路，通过复杂的视网膜脉络膜巩膜调控机制，诱导相关信使最终作用于巩膜，导致巩膜主动重塑，因此根据本实验结果，推测VIP可能与bFGF对眼球生长作用起着相拮抗的作用。VIP和bFGF作为近视信使中的两种，它们之间的关系并不能解释整个近视的复杂的网络调控机制，因此深化理解各种近视信使之间的互相作用，是否存在协同或抑制作用，将有助于说明近视的发病机制，并找到其有效的治疗手段。在今后的研究工作中，应结合分子生物学等根底医学的先进实验技术，重于讨论哺乳类和灵长类动物实验性近视发生开展中各种近视信使的作用，探索局部近视治疗药物

20、的可行性。【参考文献】1Sauelssn-Alen,NilssnSF.Pituiataryadenylateylase-ativatingplypeptide-andVIP-induedativatinfadenylateylaseintheprinenn-pigentediliaryepitheliu:effetfantagnists.JulPharalTher,1999;15(5):389-4002StneRA,LatiesA,RavilaE,ieselTN.Inreaseinretinalvasativeintestinalplypeptideaftereyelidfusininpria

21、tes.PrNatlAadSiUSA,1988;85(1):257-2603RhrerB,StellK.Basifibrblastgrthfatr(bFGF)andtransfringgrthfatrbeta(TGF-beta)atasstpandgsignalstdulatepstnatalulargrthinthehik.ExpEyeRes,1994;58(5):553-5614蒋晶晶,刘双珍,王华,吴小影,谭星平,夏朝华.外源性碱性成纤维细胞生长因子对鸡形觉剥夺性近视眼的调控.国际眼科杂志,2022;5(5):936-9385RhrerB,TaJ,StellK.Basifibrblastgrthfatr,itshigh-andl-affinityreeptrs,andthEirrelatinshiptfr-eprivatinypiainthehik.Neursiene,1997;7