2010大一暑假实验报告提取分离试验

1、2010年7月18日星期日雨按照陈老师说的，我们今天开始做黄酮分离的预试实验，大家每人各取20g粉碎过的蕨菜，包扎好放在干燥的索氏提取器中。接好在铁架台上，最上面接冷凝管，中间接所氏提取器，下面接平底烧瓶，接口一定要配套，是磨口的。蕨菜粉末袋要包好装在连通管顶的下端，以便于每次冷凝下来的水都能覆盖满粉末，从而充分浸泡，脱色。然后在冷凝管进水雨出水管口接上橡皮管，进水管橡皮管另一端套紧水龙头管口，等水浴锅温度上升到近50度才打开水龙头放水。接下来迅速往烧瓶里倒入其2/33/4的乙醚，我快速倒了乙醚。那刺鼻味简直让人窒息，加之有毒，易爆炸，使人麻醉，我是百般小心，才避免了它的危害。倒完乙醚立刻将烧

2、瓶接好，乙醚瓶要立刻盖紧，以防挥发。脱脂装置开始正常运行了，注意水浴锅内水不能过少，温度保持原样。只要等着其流出液体变为无色即可。过了好几个小时，终于完了，关掉水浴锅，取下装置，将乙醚包紧，留着处理。滤纸包仍置于所氏提取器中，放在空气流通的地方让其干燥。中文名称：旋转蒸发器英文名称：rotaryevaporator定义：一种快速液体样品浓缩的装置。样品在球形的玻璃容器中加热、减压，并不断地旋转增大蒸发表面积，加快蒸发速度。所属学科：生物化学与分子生物学(一级学科)；方法与技术(二级学科)普通蒸馏最大的不同就是通过旋转，增大溶剂的蒸发面积，使蒸发更加顺畅！现在的旋转蒸发仪也可以进行减压蒸馏，通过

3、减压，还可以补充蒸发的液体而不需要用方法：1高低调节:手动升降，转动机柱上面手轮，顺转为上升，逆转为下降.电动升降,手触上升键主机上升，手触下降键主机下降.2冷凝器上有两个外接头是接冷却水用的，一头接进水，另一头接出水,一般接自来水，冷凝水温度越低效果越好上端口装抽真空接头,接真空泵皮管抽真空用的.3开机前先将调速旋钮左旋到最小，按下电源开关指示灯亮，然后慢慢往右旋至所需要的转速，一般大蒸发瓶用中，低速，粘度大的溶液用较低转速烧瓶是标准接口24号,随机附500ml,1000ml两种烧瓶，溶液量一般不超过50%为适宜.注意事项：1玻璃零件接装应轻拿轻放，装前应洗干净,擦干或烘干.2各磨口,密封面

4、密封圈及接头安装前都需要涂一层真空脂3加热槽通电前必须加水，不允许无水干烧.4.RE-52B必须使(19)拧入保险孔内保险，以免损坏烧瓶.5如真空抽不上来需检查各接头，接口是否密封密封圈，密封面是否有效主轴与密封圈之间真空脂是否涂好真空泵及其皮管是否漏气7月19日星期一晴天气好转，经过一夜的烘干，我的蕨菜包是完全干了。所以可以重新组装装置进行提纯。重新找了一个冷凝管和圆底烧瓶，用橡皮塞连接，并将蕨菜包打开，粉末倒入圆底烧瓶里，并加百分之七十的乙醇溶解其中，一切就绪后，打开水龙头进行冷凝。水浴锅温度要调为70度。就这样让酒精帮助脱脂，两三个小时后取下将烧瓶。用布氏漏斗过滤，再将残渣加乙醇继续脱脂

5、，每隔两小时过滤一次，共做三次。乙醇要配好。获得干燥的蕨菜粉放好继续提纯。今天我们还对大孔树脂进行活化。树脂在使用前必须进行预处理，具体方法如下：1、树脂装入交换器后，用洁净水反洗树脂层，展开率为50-70%，直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止。2、用约2倍树脂体积的4-5%HCI溶液，以2m/h的流速通过树脂层。全部通入后，浸泡4-8小时，排去酸液，用洁净水冲洗至出水呈中性，冲洗流速为10-20m/ho3、用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液，按上面进HCI溶液的方法通入和浸泡。排去碱液，用洁净水冲洗至出水呈中性，冲洗流速同上。酸、碱溶液若能重复进行2-3次，则效果更佳。经预处理后的树脂

6、，在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量，以保证树脂获得充分的再生。璃件是否有裂缝,碎裂停止蒸馏操作。7月20日21日22日星期二雨先不分段直接用100%乙醇纯化，再分段萃取：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。共得8个组分，TLC检测。（尹）先纯化，30%、60%、100%乙醇洗脱，再分段萃取：环己烷/石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。共得12个组分，TLC检测。（胡）先萃取，再纯化。先用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，再不分段纯化，用乙醇直接冲柱。共得10个组分，TLC检测。（唐）先萃取，再纯化。先用环石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，后分段纯化，用30%、60%、

7、100%乙醇洗脱。共得12个组分，TLC检测。（袁）先萃取，再纯化。先用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，再不分段纯化，用乙醇直接冲柱，再用TLC检测。共得10个组分对所得粗提液显除去其.含有的百分之七十的乙醇，要用旋转蒸发仪进行旋蒸，.先用70度，除去乙醇，再用80度除去一半水即可。要将提取液放在烧瓶里开启旋转蒸发仪旋蒸。使用旋转蒸发仪时，要先开温度开关，调节温度。再开电机旋钮。旋转转速要适宜，稍慢。这样就得到无乙醇的提取液，收集在另一个烧瓶中。得到的液相再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，各做五次。萃取后这四种试剂再用旋转蒸发仪旋蒸以回收再利用。萃取时水相与待萃取相体积比

8、为1：1，先加待萃取剂于250ml的分液漏斗中，再加等体积萃取剂，经过震荡充分混合后并排完气，放在铁架台上。先静置一会儿，使其充分分层。然后打开旋钮让下层液体流下。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇都在上层，而氯仿密度比水大，故在下层。萃取出黄酮。萃取时会出现许许多多问题，阻挡你继续实验。如：出现乳胶，导致无法正常分层。我们可以用玻璃棒是气泡破掉，消除乳胶。还可以加点水和有机试剂，使其分层。甚至取下溶液用超声波震碎等等。有时还可以单独将乳化层作为一个相提取出来，如果乳化现象较为严重的话。就这样萃取得到四个萃取后的向和水相，一共五个相。接着就是把五个萃取相用旋转蒸发仪旋蒸蒸干，以回收期有机试剂。旋蒸前将放

9、气孔关闭，调好温度，接好烧瓶。注意这五种旋蒸时水浴锅温度的调试。石油醚的回收温度是6570度，氯仿为50度左右，乙酸乙酯为60度左右，正丁醇是8590度。前面已经得知乙醇回收温度为70度左右，乙醚为20多度，而睡则为80度左右。然后就是慢慢的旋蒸了，由于旋蒸仪不够，我们四个排队使用，效率不是怎么高，蒸了好久才完，蒸干后用甲醇或乙酸乙酯用滴管将其从烧瓶中洗出来。这一步结束后获得五个相，怎么办呢？接着就用大孔树脂过滤，事先活化好大孔树脂，在装到小点的层析柱中。一定要注意水一定一直比大孔树脂高度高，以免产生气孔。若产生气孔，就需要倒出重新装。将所得提取剂倒入柱内让大孔树脂充分吸收器有效成分黄酮。随后

10、用水冲一遍，得到水相。再用纯乙醇冲洗一遍得到乙醇提取相。然后用乙醇洗一遍，换用其他有机试剂。获得物再旋蒸即可得到所要的馏分，同样方法用毛细管取馏分液体，往硅胶板上点样。用TLC检测黄酮含量即结束预实验。7月24日星期六多云今天终于将预实验做完了，我得到了七种馏分。然后陈老师马上教我们做点滴，有试了用玻璃刀切玻璃。将硅胶玻璃切成方形，留着点样用。还学习了毛细管的使用及清洗。我们买了把玻璃刀，用来切割玻璃制作硅胶板。7月30日星期五多云转雨由于陈老师今天要我们把实验结果给他，而且我的实验任务比较重，要留十八个馏分。所以昨晚加了会班把馏分得到了。到今天上午还有正丁醇萃取的两个样没蒸干。上午一直放在旋

11、蒸上蒸。下午在点样和跑板，老师拍了照片。最后我们集体打扫了卫生，把实验室收拾干净。将仪器整理好，刷干净，摆好。果然503实验焕然一新，我们自己看了都感到激动，干活也更积极了。今天主要是为了明天开始的大规模实验做足准备。我们找了大的冷凝管12个，以及相配套的烧瓶、橡皮塞。安装好便置于桌面等待使用。我们分工协作我和尹兴坤刷小仪器、试管，他粗洗我来用自来水冲。胡小玉学长和袁绪甫刷大的。刷好摆放在试验台上，好一片整齐的场景。下午点样是由于我要点18个点，另加芦丁和槲皮素作为对照,（芦丁和槲皮素是黄酮的一种），点过多。所以我用两个硅胶板点样，两个硅胶板都有芦丁和槲皮素，故共有22个样点要点。而且还要用三

12、种展开剂进行跑板，所以我必须点样6个板，共计66个点。这确实不是多么轻松啊。但这让我更好的练习了点板，功底果然见长。7月25日星期一晴昨天我们将做好的预实验结果得到的样品用硅胶板进行了点样，认识了黄酮。黄酮是在紫外光为254nm下呈现黄色，它又含有酮基，顾名思义得名黄酮。陈老师比较倾向于先用大孔树脂不分段纯化，再萃取的方案。因为大孔树脂只能粗提，过滤大分子化合物，如糖类。分段纯化没什么效果，最后点样其图像一模一样。今天我们要再做一次预实验，我做的是先称取50g脱脂蕨菜粉，再用百分之七十乙醇粗提。接好冷凝管与烧瓶。用乙醇溶解该50g蕨粉，需要250300ml无水乙醇。还要清洗好提取装置。安装好装

13、置将烧瓶放在水浴锅里，并将水浴锅温度调为70度左右，开始加热。粗提一段时间取下取下装置，用布氏漏斗抽滤滤掉杂质。只倒上清液，沉淀舍去。抽滤要用两层滤纸。共粗提三次，将最后获得的液相放一块。将获得物回收乙醇。将所得液置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，温度调为70度，以除去乙醇。关掉出气阀门，开启冷凝水，使茄型瓶旋转。等冷凝管几乎无液滴滴下时，开始将水浴锅温度设为80度，以除去水中混的乙醇出去。约除去刚才溶液的一半留下即可。随后将茄型瓶中所得物倒出，再用水洗，二者并在一起。接下来安装大孔树脂柱。先倒入少量水于柱内，再将与水混合好的大孔树脂倒入柱内，最后柱顶要留几厘米水柱，以防止柱内出现气泡，影响纯化。上样

14、。将所得无乙醇的粗提物溶解，加热或用超声使其充分溶解，无沉淀为止。接着倒入大孔水柱中，并控制柱底的滴速，不能太快(每1.5秒一滴)。下面向柱内倒水，纯水。冲洗5个柱体积(BV)的水为止，这些水相保留。然后依次用百分之30、60、100的乙醇冲洗，每个依次冲洗7个柱体积为止。我的柱体积约为70ml共得到三个冲洗后的液相.并各取少许液体放小瓶里收集点板用。随后对这三个液相萃取，分别依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每个萃取剂要萃取5遍。每个萃取时，共得到水相和提取相。3个水相加12个提取相，共15个，还包括前面收集的三个过大孔流下的3个，共计18个相。将所得的再旋蒸回收有机试剂即可，回收时

15、不要等其蒸干要提前拿出，再用甲醇或乙酸乙酯洗出即可。将所得18个馏分点样，同样方法用毛细管取样，往硅胶板上点样。然后再将硅胶板置于254nm紫外线下观测，测其Rf值分析黄酮含量。（Rf值=样点迁移值/硅胶板展距，是一种反应化合物极性或电负性的标准。如果是黄酮话，其Rf值一样。）（石油醚的回收温度是6570度，氯仿为50度左右，乙酸乙酯为60度左右，正丁醇是8590度。前面已经得知乙醇回收温度为70度左右，乙醚为20多度，而水则为80度左右。）7月27日星期二雨今天做了乙醇的回收和提取液过大孔树脂。7月28日星期三晴30七点多起床后立刻跑到503用大孔树脂柱过滤水相，在过滤之前，我是用布氏漏斗真

16、空泵抽滤了一次，以求再一次除去杂质。然后才上大孔。这样就不会有大颗粒堵住柱体，顺畅过滤。用水过滤时加了好多水才使从柱内流出液体颜色变淡，足足有一千多毫升。用水冲洗时其流速可以稍快，以节约时间。用水冲洗后换用。7月31日星期六晴雨晴今天我们团队开始了大规模的实验，一切准备就绪，只欠东风。将三个水浴锅找好，冷凝提取装置连好，每烧配好取800ml百分之80的酒精和80g蕨菜粉，脱过脂的。（前些天我们还在用滤纸包蕨菜粉，然后放在那大的所氏提取器里，每次大约装五包。还经常加乙醚，一个人拖着冷凝管，一个人去塞子，并扶着大烧瓶另一个同学往里加乙醚就行了。）我们又是分工协作，两个人陪乙醇，两个人称蕨粉，然后往

17、烧瓶里加蕨粉和酒精。之前我们已把冷凝提取装置安好，并将进水管出水管串联完毕，还用绳子系好塑料管接口。一切接好后，打开水浴锅，通入自来水，开始工作。过了几个小时，下午四点时我们取下装置，对蕨菜提取液进行抽滤，然后我用旋蒸回收乙醇。我们先进行了一公斤蕨菜粉的提取，用去一升酒精。总共需做这十倍的工作。8月1日星期日晴提取稳步进行，今天是将第一次提取工作做完了。我们四人分好工。上午做第二遍时，我仍然用旋蒸回收乙醇。温度调为68度，蒸发速度还蛮快的，不一会便搞定了。我用一个大桶回收旋蒸后留下的提取液，将酒精放在另一个玻璃容器内。我们先要将烧瓶从提取装置下掉，共十二个，已编号号码。去掉烧瓶后立刻将提取液用

18、真空抽滤，再加酒精，是配好的百分之80的乙醇。8月2日星期一晴热早晨起来我们继续工作，我仍然用旋蒸回收乙醇。温度调为68度，蒸发速度还蛮快的，不一会便搞定了。我用一个大桶回收旋蒸后留下的提取液，将酒精放在另一个玻璃容器内。我们先要将烧瓶从提取装置下掉，共十二个，已编好号码。去掉烧瓶后立刻将提取液用真空抽滤，再加酒精，是配好的80%的乙醇。然后我称蕨菜粉，并将称好的放入烧瓶里，倒入酒精再重新安装到提去装置。我们还用酒精计测量酒精密度仪配制80%的酒精。可是没有合适量程的酒精计，有两个;一个是070%的，一个是90%100%的，所以只能配和使用。我们自己积极发挥自主创新的能力，想出来一种方法，用90%100%量程酒精计的90刻度线的液面与酒精计浸入水中起始刻度间距离。计算为2.2cm，只要满足着就可以配好酒精。8月4日星期三晴今天是三遍提取的最后一次，这次结束后这一公斤的蕨菜就可以进行纯化了。我今天主要配置酒精，用浓度较大的配置浓度较小的80%的乙醇。按照我们那套方法，我是将酒精放在大储存瓶里配置，一次能配置好几千毫升的酒精，甚为舒服。仍然用酒精计，先往瓶里到个大概，如果酒精计往下沉，说明密度小了。由于酒精密度比水的密度小，所以加水增加密度使酒精计上浮，反之亦然。就这样，配好了将其倒入待装酒精的烧瓶，