化合物抗体的制备与应用材料

1、第五章化合物抗体的制备与应用一些分子量小于4000的有机物质，如多肽、大多数的多糖、甾族 激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些小分子量的药物等能与对应抗体 结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体，它 只有反应原性，不具免疫原性，称为半抗原，又称不完全抗原。该类 化合物其本身不具有免疫原性，但当其与蛋白质大分子或其他高分子 量物质结合后形成完全抗原，可以刺激机体产生相应的抗体。半抗原 性免疫原的制备是其抗体制备的关键技术之一。在其产生的抗体中， 针对偶联载体的抗体占多数，因此，在化合物抗体的制备中，构建快 速，有效的筛选方案和技术成为其抗体制备的另一关键技术。目前，化合物抗体已经成

2、功的应用于药物分析，农药残留检测， 重金属检测等多个方面，为医学检测，环境保护等发展奠定了坚实的 基础。5.1半抗原性免疫原的制备半抗原性免疫原的制备是其抗体制备的关键技术之一，其主要包 括偶联载体的选择，偶联方式的选择等方面的内容。5.1.1载体的选择常用于半抗原偶联的载体包括蛋白质，多肽类聚合物，大分子聚 合物和某些颗粒等。蛋白质是空间结构比较复杂的生物大分子，是一种良好的载体。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、牛甲状腺球蛋白 等。以牛血清白蛋白最常用。蛋白质与半抗原结合基于游离氨基、羧 基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基等活性基团的缩合。多肽类聚合物是人工合成的多肽聚合物，

3、常用多聚赖氨酸，分子 量达十几万至几十万，与半抗原结合后可诱发动物产生高亲和力及高 滴度的抗血清。大分子聚合物和某些颗粒包括聚乙烯毗咯烷酮、活性炭、羧甲基 纤维素等。5.1.2半抗原与载体的结合半抗原与载体结合的方法包括化学法和物理法。物理法是具有物 理吸附能力的载体通过电荷和微孔吸附半抗原，物理吸附的载体有羧 甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮等。化学法是利用功能团将半抗原交联 固定在载体上，这些载体包括血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、 卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。带有游离氨基或游离羧基以及两种 基团都有的半抗原，可直接与载体连接。其他不带有氨基或羧基的半 抗原，须加以适当的改造，使其转变为带

4、有游离氨基或游离羧基的衍 生物，才能与载体连接。半抗原与载体连接时，应选择合适的方法，结合方式的选择应考 虑如下因素：1）半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不导致半抗原活性 的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。2）结合键的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好 的特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。3）选择适合的偶联试剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗原 的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽类有一 定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结构的稳定。因此， 用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能代替被取代的每一 个8-氨基的正电荷。蛋

5、白质与偶联剂接触后，使不同蛋白质分子的 功能基团交联并凝聚。广泛交联的蛋白质，其溶解度常降低，而这种 溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。半抗原与载体的连接一般在实验室皆可完成，但反应条件须严格 控制，以防半抗原失活或载体严重变性。因此，半抗原与载体连接方 法的选择与设计是制备抗体中最具挑战性的关键性步骤。常规的连接 方法包括以下几类：1）有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原与载体的连 接方法（1）碳化二亚胺法：碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功 能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。此 法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的 溶液中，然后加

6、入碳二亚胺，搅拌l2h，置室温反应24h，最后透 析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。（2）戊二醛法：戍二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它 借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下：（3）混和酸酐法：混合酸酐法又称为氯甲基异丁酯法，主要用以 甾体激素与蛋白质的偶连。以烷基氯甲基为偶连剂，最常用的是氯甲 基异丁酯。含有羧基的半抗原与氯甲基异丁酯反应形成混合酸酐，然后在与蛋白质载体上的氨基反应形成肽键。其反应如下：（4）过碘酸氧化法：过碘酸将糖环氧化成双醛基，再与蛋白质上 的氨基偶联。本法常用于配糖体类药物与蛋白质的偶联。2）不带有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后

7、，再用上述方 法进行连接（1）琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗原的改造。琥珀酸 酐加水转变成琥珀酸。如将带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水毗啶 中反应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。其反应式如下：（2）羧甲基羟胺法：带有酮基的半抗原（如孕酮、睾酮）与0-（羧 甲基）羟胺反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。其反应式如下：（3）重氮化的对氨基苯甲酸法：本法适于带有酚基的半抗原（如 某些药物）的改造。先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产物再 作用于带有酚基的半抗原，从而制得带有羧基的半抗原衍生物。（4）一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。将带有酚基 的药物与一氯醋酸钠反应即可得到带有羧基的半抗原衍生物。5.2化合物抗体的应用目前化合物抗体已经应用于农药残留降解的检测。研究者建立了 多项化学农药残留免疫检测技术，实现了对同类农药的同时在线检 测。以二乙基磷酸乙酸为半抗原与适当的载体连接合成人工免疫原， 免疫后获得了针对双乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的