大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化

1、大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化创新实验I-化学生物学课程组 王骊丽实验四NORTHWEST UNIVERSITY化学国家级实验教学示范中心1医学ppt基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解；蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法； 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法实验技能训练要点主要新知识2医学ppt仪器分析：色谱技术 液相色谱技术仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振 化学生物学导论：蛋白质、酶蛋白质与酶化学：重组DNA技术蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征.

2、有机化学：荧光探针实验技能训练要点主要知识回顾3医学ppt背景知识实验室研发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品，包括以下步骤：目的基因DNA片段的获得；E.coli 重组表达载体的构建；在E.coli 中对目的基因进行表达；目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯化；规模化生产工艺（包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。关键词：重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by li

3、quid chromatography4医学ppt实例：粒细胞白血病粒细胞白血病(ML) 在我国其发病率占成人新诊断白血病20%以上，年发病率为10万分之1。5医学ppt人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用HSCCLPCMPGMPMEPPro-TPro-BTBNK单核细胞粒细胞巨核细胞红细胞SCF;IL-2SCFEPOSCFSCFSCFSCFIFN-SCF基质细胞SCF6医学ppt名称氨基酸残基数 二硫键数相对分子质量与等电点主要产生细胞主要生物学rhG-SCF 177 分子中含有5个半胱氨酸残基，可形成两个二硫键19.6kD;pI 6.0巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞能高度特异性的刺激

4、中性白细胞系的前体细胞存活、增殖和分化，同时也是成熟的中性白细胞的功能活化因子rhG-CSF的理化性能与生物学功能7医学ppt复性与纯化方法添加剂质量回收率(%)纯度(%)生物活性(108IU/mg)IEC3.0 mol/L urea,2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG49.0963.0HICN.R.42.696.82.1SEC15% glycerol (v/v),2.5m mol/L GSH, 0.8 mM GSSG30.0831.2脲梯度SEC15% glycerol (v/v), 2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG46.1N.R

5、1.0AFC2.0 mol/L urea32.0971.8AFC3.0 mol/L urea39.0972.3几种PFLC法复性与纯化rhG-CSF包涵体结果比较8医学ppt实验内容提要一、实验目的二、实验原理三、实验仪器与试剂六、实验延伸五、实验结果与讨论四、实验步骤与方法 思考题 参考文献西北大学化学与材料科学学院9医学ppt一、实验目的掌握包涵体的变性、复性的基本原理；熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法；熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。 通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特

6、点;了解二硫键形成与构象的关系；10医学ppt基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术;以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。二、实验原理-基因工程技术11医学ppt大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在；包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性；包涵体能够溶解于强的变性剂，如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。二、实验原理

7、包涵体的形成和特点 超声破碎包含体外周质胞浆沉淀 可溶部分洗涤溶解离心离心包涵体复性12医学ppt直接稀释法（Direct dilution），包括透析法和超滤法液相色谱复性法（Chromatographic methods for protein refolding） 人工配基辅助的蛋白复性（Artificial molecular chaperone assisted protein refolding)二、实验原理体外复性的主要途径13医学ppt液相色谱复性蛋白的过程蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。

8、14医学ppt三、实验试剂和仪器 尿素（成都金山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；三氟醋酸（分析纯，Fluka公司）；硫酸铵、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯（西安化学试剂厂）。-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）均购自Sigma公司（St. Louse，MO，美国）。试剂西北大学化学与材料科学学院15医学ppt三、实验试剂和仪器纯水仪离心机二氧化碳培养箱快速蛋白纯化仪日立F-4500荧光光谱仪仪器16医学ppt天数实验内容实验准备相关知识点第1天包涵体粗分离、溶解配制变性剂及其缓冲液，装填色谱柱细胞的破碎，离心技术第2天利用稀释法、HIC法进行包涵体的复

9、性与同时纯化配制色谱流动相稀释法、色谱复性与纯化原理第3天理化性质分析，分子量，蛋白质含量SDS、质谱紫外分光光度计电泳、质谱技术第4天一级结构、高级构象、生物学活性荧光光谱仪、配制测定活性缓冲液荧光光谱、MTT法第5天数据处理、整理实验报告环节1环节2环节3四、实验步骤与方法实验天数17医学ppt四、实验步骤与方法PCR扩增技术获得rhGC-CSF基因插入克隆载体进行测序回收扩增片断插入表达载体表达5L或50L发酵罐蛋白的生物活性和理化性质分析正确的基因筛选表达最好的菌株获得包涵体蛋白多种方法复性重组包涵体蛋白获得有活性的蛋白18医学ppt四、实验步骤与方法-流动相组成普通SEC：0.15

10、mol/L NaCl ，3.0 mol/L urea ，0.05 mol/L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA + 1.0 mmol/L，pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG ，15%甘油;脲梯度SEC：A为 0.05 mol/L Tris (pH 8.0) ，1.0 m mol/L EDTA ， 0.15 mol/L NaCl ，2.5 mmol/L GSH + 0.8 mmol/L；B为 8.0 mol/L urea。19医学ppt1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化流动相平衡Superdex 75(16/20)柱子，然后将200 L 8.0 mol/L脲溶解变

11、性的rhG-CSF溶液直接进样到平衡好的色谱柱中，用平衡时所用的流动相洗脱复性的rhG-CSF。流速1.0 4.0 mL/min，检测波长为280 nm。收集复性的rhG-CSF馏分，测定蛋白浓度。将收集液用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L NaAc缓冲液(pH 4.0)透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于测定生物活性。20医学ppt2、脲梯度SEC复性rhG-CSF用流动相A和B按一定比例的混合液平衡色谱柱，然后在10或者15 mL内将B液浓度增至100%。按上述方法平衡后，将不同体积还原变性的rhG-CSF直接进入SEC色谱柱，然后以2.0 mL/min的流

12、速用B液洗脱。检测波长280 nm。收集复性的rhG-CSF，用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）透析。透析后的含rhG-CSF的溶液用来测定蛋白浓度和生物活性。21医学ppt优化的条件下复性与纯化普通SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris, 1.0 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG , 3.0 mol/L urea ,15% 甘油 (v/v) ，pH 8.0 ；脲梯度SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 m

13、ol/L Tris,1.0 mmol/LEDTA ,2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG ,15% 甘油 (体积比)，pH 8.0；流动相B：流动相A+ 8.0 mol/L 脲流速为2.0 mL/min, 检测波长280nm22医学pptrhG-CSF的SEC复性与同时纯化产物色谱图；复性与纯化产物SDS分析图；紫外分光光度法测定复性与纯化产物含量结果；荧光光谱表征复性前后的构象；五、实验结果与讨论23医学pptSEC复性rhG-CSF的色谱图实线代表rhG-CSF的洗脱曲线，* 表示复性的 rhG-CSF脲梯度SEC复性rhG-CSF的色谱图五、实验结果与讨论-色谱

14、图24医学ppt 1 2 31, rhG-CSF 包涵体提取液; 2, 分子量标准蛋白(从底部到顶部依次为14,400; 20,100; 31,000; 43,000; 66,200; 97,400 Dalton);3, SEC复性并部分纯化后的rhG-CSF五、实验结果与讨论-电泳分析25医学ppt进样量 (L)脲梯度SEC的比活 (107 IU/mg)脲梯度SEC的质量回收率 (%)普通SEC的比活(107 IU/mg)普通SEC的质量回收率 (%)10012.853.212.331.420012.152.811.930.150010.446.18.124.77008.941.77.019

15、.110008.131.85.89.3脲梯度SEC和普通SEC对rhG-CSF复性的比较五、实验结果与讨论-对比分析26医学ppt五、实验结果与讨论-蛋白的构象表征圆二色谱法荧光光谱法27医学ppt使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。五、实验结果与讨论-注意事项28医学ppt六、实验延伸-二硫键对接 Zhang L, Chou CP, Moo-Young M.

16、 Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia coli expression system. Biotechnol Adv 2011; 29:923929医学ppt最具有代表性的是多维能量景观学说（multidimensional energy landscape)和折叠漏斗(folding funnel)模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。蛋白折

17、叠的漏斗形能量景观图六、实验延伸-蛋白质折叠机制30医学ppt实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应六、实验延伸-蛋白折叠研究新技术31医学ppt思考题蛋白质的CD光谱与其分子构象有何关系？圆二色性光谱法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？蛋白质的紫外光谱与其分子构象有何关系？该方法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？你能否通过关键词，查阅和设计一个有功能细胞因子从基因克隆、表达与复性的实验？32医学ppt参考文献 Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation with simultaneous purification of rhG-CSF from Esch

18、erichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-1296Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Escherichia coli using size exclusion chromatography, J Liquid Chromatogr. & Related Tech., 2006, 29:203-217Wang CZ, Wang LL, Geng XD. High recovery refolding of rhG-CSF from escherichia coli using urea gradient size exclusion chromat