中国贵州兰科植物白及内生真菌多样性及生态分布研究

1、中国贵州兰科植物白及内生真菌多样性及生态分布研究兰科植物是被子植物最大科之一, 是重要的观赏花卉和药用植物 , 这类植物要与特定真菌建立共生关系 , 才能完成正常的生长发育 , 这些独特的特征使兰科植物成为植物与真菌协同进化、 真菌多样性和专一性等方面研究的重要材料。 本研究选择贵州境内普遍分布的兰科植物黄花白及(Bletilla ochracea Schltr.)为研究材料, 采用传统培养分离方法与分子生物学方法相结合, 通过对分布在不同地区的白及(B.ochracea) 材料的叶和根组织内生真菌的分离频率、种类组成、多样性指数和主成分分析等研究, 揭示白及叶和根组织内生真菌类群的多样性组成

2、及生态分布, 探讨地理环境因素对内生真菌类群多样性和生态分布的影响。通过对贵州 5个地区采集的 32份白及 (B.ochracea) 植株材料的 1800个根和叶组织段 (块)分离内生真菌, 共分离菌株1028株, 根据形态学特征和形态型菌株的rDNA的5.8S基因和ITS序列的相似性比较和分子系统发育分析确定为90个分类单元 , 其中 33 个鉴定到种 ,42 个鉴定到属 ,15 个鉴定到科及以上水平。从叶组织共分离 775株,鉴定为 46个分类单元 ,分别属于 14个属 36种和10个只鉴定到目及以上水平的分类单元 ; 从根组织共分离253株 , 鉴定为 47个分类单元 , 分别属于 19

3、 个属 42 种和 5 个鉴定到科及以上水平的分类单元。其中 ,2 个兰科菌根真菌属 (Epulorhiza 和 Sebacina)14 个种类在分子水平上与其他地区的差异明显, 即 Epulorhiza sp1-sp5 、 Epulorhiza sp7 、 Sebacinasp1-sp8 。内生真菌类群中能够产生孢子及相关鉴定特征的有697 株 , 包含 38 个分类单元 , 属于 12 个属 36 个种 ,2 个鉴定到科的水平, 占分离菌株总数的 67.8%,产孢菌株中有221 株分离自根组织, 有 476 株分离自叶组织。其中 ,有 19种子囊菌 ,19 种担子菌 , 担子菌全部分离自根

4、组织。不能产孢及鉴定特征的形态型菌株有331 株, 占分离菌株总数的 32.2%,划分为 51 个形态型。通过 ITS 区序列的相似性比较和分子系统发育分析等方法鉴定为 39个分类单元 , 属于 21 个属 ,17 个鉴定到种 ,21 个鉴定到属 ,1 个鉴定到目 ,其中 2个属于担子菌 , 其他 37 个属于子囊菌, 还有 12 个形态型菌株无法鉴定。通过ITS-PCR、随机克隆、DGGI8口系统发育分析等方法检测和鉴定了贵州清镇白及 (B.ochracea) 材料的根和叶组织中内生真菌类群组成和多样性。从叶组织共得到 203 个内生真菌的 ITS 区序列的克隆, 通过分子鉴定为 18个不同

5、的OTUs包括15种子囊菌(91%),3种担子菌(9%);其中Mycosphaerella、Alternaria 、 Colletotrichum 、 Leptosphaerulina 和 Dioszegia 属以及 1 个未鉴定的子囊菌 Ascomycetesp.2 为优势类群; 来自根组织内生真菌的 ITS 区序列的克隆为211个，属于10个不同OTUs包括9种子囊菌(54%)和1种担子菌(46%),其中 Sebacina 、 Fusarium 、 Gibberella 和 Nectria 属种类为优势类群。结果表明，叶组织中内生真菌的多样性指数(H ,2.354)要高于根组织的(H ,1

6、.560),而且叶和根组织中内生真菌是两个完全不同的类群 ; 与传统培养分离方法比较,分子方法检测到的内生真菌类群组成差别明显 , 有些优势类群和非优势类群不能在两种方法的结果中同时体现。对贵州 5 个地区的白及(B.ochracea) 根和叶组织内生真菌类群的生态分析表明 : 根组织内生真菌的优势类群主要属于 Epulorhiza 、 Ceratorhiza 和Sebacina 3个担子菌属(56.40%相对分离频率，RF)以及子囊菌(10.74%RF)的Phomopsis和Fusarium属，而叶组织内生真菌的优势类群主要属于Colletotrichum(68.26%RF) 、 Guign

7、ardia(14.10%RF) 和 Cercospora(7.36%RF)3个属 ; 这些优势类群在不同地理位置的生态分布是有差别和不均匀的 ; 不同地理位置和环境因素对内生真菌类群的丰度和分布有明显的影响 ; 不同地理位置的内生真菌类群多样性(H)趋势是根组织的要比叶组织的高；不同地理位置的根内生真菌类群间相似性系数(Cs) 很低 , 而不同地区的叶内生真菌类群间相似性系数(Cs) 要明显高于根的 , 这与叶内生真菌类群在不同地区的生态分布差别和不均匀要小于根的结果相一致; 根和叶组织内的真菌类群是两个完全不同的群落, 来自根和叶组织的真菌类群的相似性系数(Cs) 接近于零 ; 根组织的内生真菌多样性与经度、海拔和纬度都有一定的相关性, 但在叶组织中则没有体现相关性。本研究首次对不同地理环境的白及(B.ochrac