免疫测定方法学和临床应用精选课件

1、免疫测定方法学临床应用 1免疫分析技术简介乙肝病毒标志物定性、定量检测常见问题抗HCV检测问题ANA.ENA检测问题TP-Ab检测问题TB-Ab检测问题免疫测定方法学临床应用2免疫分析技术早期的免疫分析技术: 免疫扩散、免疫电泳、直接及间接血凝、被动血凝、补体结合实验特点:这些检测方法成本低、结果易于判断、技术上便于掌握,但不便于免疫检测自动化 后来的免疫分析技术: 放射性核素标记、荧光免疫标记、酶免疫标记、稀土元素标记及化学发光分子标记特点:快速、灵敏、特异、易于测定等实验室的免疫检测自动化奠定了基础 3 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/m

2、Lng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins免疫分析技术4放射免疫的创立1959 美国Yalow & Berson1960 英国 Ekims1977 获诺贝尔医学生物学奖医学生物学超微量分析的里程碑免疫分析技术5放射免疫的精髓R：放射性核素示踪高灵敏不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应)RIAI：免疫学反应高特异废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗

3、体为结合剂免疫分析技术6放射免疫面临的挑战半衰期短，限制了药盒使用寿命由于标记物的不断变化，带来药盒批间、批内较大的差异，标准曲线无法保存备用反应时间过长(数小时至过夜)结果测量依靠时间累计，至少每一样品一分钟其主要的缺陷是：理论和实践证明其分析的限度是10-7分子/mL或10-12 g/mL，要再提高有困难以上原因都造成放射免疫无法进行自动化分析免疫分析技术7新技术的挑战放免其必然受到一代新的更灵敏、稳定、快速，而且全自动化的测量技术的挑战。从90年代开始放免分析在国际上每年以 1015% 的速度下降，这是事实。一些大型的实验室，标本量大的项目都已逐步应用各种非放免标记的自动化设备来进行分析

4、，这是技术发展的必然规律。免疫分析技术8标记免疫方法免疫分析技术9自动标记免疫分析的优点一、消除手工操作的误差二、灵敏度高、稳定性好三、速度快四、当天/隔天报告 实现短时间反馈提高临床诊断效率和质量，有效降低总医疗费用免疫分析技术10乙型肝炎病毒乙肝的诊断主要以实验室检测乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）为主，检测方法主要有酶免疫法、反向间接血凝法、放免法、化学发光法、免疫荧光法等，目前应用较广、较普及的是酶免疫一步法和化学发光定量法。HBsAg 的酶免疫检验方法根据反应模式可分为“一步法”和“两步法”两种方法。“一步法”是将待测样品和酶标

5、记抗体同时加人到反应孔中进行反应，从而达到快速的目的，一步法”存在产生“前带现象”的可能 。11定性？定量？定性测定常以“有”或“无”也即“阳性”或“阴性”来表达测定结果；半定量测定虽介于定性和定量之间，但从严格意义上来说，其仍属于定性测定，只不过其对定性测定中的“阳性”作了进一步的分级，即所谓的强阳性阳性弱阳性的区别定量测定的结果则以浓度（如IU/L、ug/L等的方式表达。乙肝病毒标志物12定性测定结果确定的依据定性测定结果确定的依据在于阳性阴性判定值（Cut-off）的建立， Cut-off 值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现。因此卫生部临床检验中心也在应用Cut-off 值时

6、引用了灰区概念以解决定性测定结果的可疑阳性问题。 乙肝病毒标志物13定性免疫测定的CUT-OFF值与灰区SD1=0.019 SD2=0.628乙肝病毒标志物14可疑阳性处理原则重复测定：同样方法复做一次确认试验：中和试验：HBsAg 重组免印迹（RIBA）：HCV-Ab 蛋白印迹（WB）: HIV-Ab结合临床或跟踪随访乙肝病毒标志物15定量测定结果的依据系列浓度标准品测得的剂量反应曲线，即通常所谓的标准曲线。由于定量酶免疫测定中的剂量反应曲线与生化测定中的标准曲线相比，一般均为非线性的，变异较大，故不宜称为标准曲线。不同的数学模式可用来改善上述剂量反应曲线绘制的精密度，从而能以较少的数据和计

7、算获得较为准确的结果乙肝病毒标志物16定性测定与定量测定分别定性测定 定量测定结果报告结果判定测定方法的变异系数（CV%）临床意义阳性/阴性临界值 Cutoff（CO）CO 阳性CO 阴性1520诊断浓度：g/L (ng/mL) U/L (mU/mL)根据标准品计算7%诊断、病情、治疗监测乙肝病毒标志物17Elecsys 与酶免法的主要区别检测灵敏度Elecsys HBsAg:0.09ng/ml对酶免法(0.550ng/ml)，因此酶免法有较高的阳性漏检率，尤其对于早期患者； Elecsys HBsAg不存在灰区，减少重测，结果更可靠。结果的精密度 5% CV值与20% CV值的差别, 酶免法

8、结果可靠性差。出结果时间 来样本即检测出结果(18分钟-27分钟)与集中标本检测后出结果（34小时）报告的分别。酶免法与国际标准值未接轨乙肝病毒标志物18丙型肝炎的实验室诊断丙型肝炎(Hepatitis C，HC)是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的世界范围内流行、且严重危害人们身心健康的传染病之一, 尤其在亚洲、非洲等一些发展中国家,流行率、发病率均较高。临床特点：感染者中50-85发展成慢性或持续感 染、进而部分发展成肝硬化和肝癌。 因此，早期诊断仍是防止传播的有效手段。19丙肝病毒抗体20丙肝病毒抗体21一、抗-HCV IgG检测 酶联免疫吸附实验 凝集实验

9、 放射免疫实验 快速检测技术 其它检测技术：免疫荧光、化学发光等 补充/确认实验:重组免疫印迹 (RIBA) 丙肝病毒抗体22酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 检测原理：利用固定在固相载体上的HCV重组表达和/或人工合成多肽抗原捕捉待测样品中的抗-HCV IgG,然后,通过加入酶(如HRP、ALP等)标记的抗-人IgG检测所捕捉到的特异性抗-HCV IgG。丙肝病毒抗体23HCV不能体外培养,大量HCV天然抗原几乎得不到.目前主要用基因工程表达和多肽合成方法得到。用什么区段的丙肝病毒抗原蛋白？如何选择各种抗原合适的比例？是保证

10、HCV试剂测出样品中所有的抗-HCV抗体的关键。包被抗原的选择丙肝病毒抗体24抗体临床意义CHCV感染后出现较早,阳性率也很高,在抗-HCV检测中发挥重要作用NS3抗原的免疫原性很强,相应的抗体滴度也很高,HCV感染后出现很早,同C区抗体一样在抗-HCV的检测中发挥重要作用NS4 HCV感染后出现延迟,持续阳性可能与慢性化有关NS5HCV感染后出现较早,可用于急性期感染的诊断HCV各片段抗体检出的临床意义丙肝病毒抗体25第一代抗-HCV检测系统cDNA克隆5-1-1：1989年5月,美国Chiron公司分离到一个能表达NANB肝炎病毒特异性蛋白的cDNA克隆5-1-1。C100-3：又将3个与

11、5-1-1有共同的重叠克隆连接起来建立了另一个克隆C100(部分NS3和NS4区重组表达抗原)； HCVC100-3抗体检测系统,是最早的检测方法.丙肝病毒抗体26 主要缺陷是：灵敏度低,漏检率较高：C100只含363个氨基酸,只代表整个HCV抗原抗体系统的一小部分；抗体检出时间较晚：不适于早期诊断。非特异性反应较高：使用的抗原含SOD融合蛋白,因此,当人体存有抗-SOD时常常出现假阳性。丙肝病毒抗体27第二代抗-HCV检测系统C区较E区和某些非结构区蛋白都保守,用C区基因产物检测HCV抗体显得更加合理;第二代试剂除上述C100抗原外又加上了HCV核心区多肽C22-3和非结构区抗原C33C。较

12、第一代试剂检出率提高25-30%,抗体出现提早到16-60天。丙肝病毒抗体28 不足：由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题,于是激发人们建立人工合成肽段检测抗-HCV的新试剂。 丙肝病毒抗体29第三代抗-HCV检测系统核心区抗原比例相对下降,而相应也增加了NS3区C33C的比例,优化了试剂盒的组装工艺；利用现代基因重组技术,对一些重要抗原采用更好的表达、纯化系统,利用先进的生产工艺、使包被抗原的活性更强,增加了检测的灵敏度,减少了非特异性反应；加入了NS5区抗原。丙肝病毒抗体30目前我国多采用第三代抗-HCV ELISA试剂,其敏感性超过99%,虽然目前缺

13、乏判断其敏感性的金标准,但对于免疫功能正常的HCV RNA阳性感染者,抗-HCV检出率也高于99%。 丙肝病毒抗体31补充/确认实验:重组免疫印迹 (RIBA) 检测原理：以待测血清中的HCV抗体和分别固定在硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜等载体上的不同HCV抗原之间的特异性结合反应为基础,测定待测样品中抗-HCV的存在和有无。丙肝病毒抗体32因为HCV的各种抗原分别被单独固化在载体的不同位置上,因此,该项检测可以区分待测样品对HCV不同抗原的不同反应。目前RIBA HCV已经得到FDA的认可,成为抗-HCV确认的标准。临床意义：RIBA阳性的患者中75-80%为病毒血症(HCV RNA);

14、RIBA阳性而血清中没有HCV RNA时提示可能为既往感染。丙肝病毒抗体33 实时荧光监测PCR检测原理：在PCR扩增反应管内加入了标记有两种染料的针对靶序列的探针,每当一次扩增反应中一条探针与靶序列退火结合后,整个反应体系就会增加一个单位的荧光.从而得出每一次扩增循环结束后产物的量.丙肝病毒抗体34 临床意义：特异性强：抗-HCV阳性并不能代表现症感染,丙型肝炎的诊断标准是HCV-RNA.敏感性高：可发现抗-HCV阴性者HCV感染.阳性出现早：在“窗口期”没有抗-HCV产生,但可检测出RNA. 可指导用药：为疗效观察及预后判断提供指标.丙肝病毒抗体35 与HBV DNA相比，HCV RNA检

15、测更为复杂和困难,检出率低:血清中病毒含量低,且有一定波动,呈间歇阳性;易被RNA酶降解;HCV RNA受进食的影响,HCV易与血中脂质及脂蛋白结合,致使其检出率降低;二次PCR,其中任何步骤的问题均易影响其检出。丙肝病毒抗体36应用EIA S/CO比值报告抗-HCV结果试剂Ortho 3.0华大吉比爱金伟凯华美科化英科新创万泰S/CO比值 3.8 7.0 10.0 6.0 10.0 8.6 10.0阳性预测值 96.1% 96.1% 96.1% 97.3% 96.0% 96.1% 96.0%任芙蓉,等. 中华肝脏病杂志, 2019,13:255-258丙肝病毒抗体37 抗-HCV筛查检测报告

16、阴性或根据S/Co比值判定为阳性所有阳性结果高S/Co比值阳性*报告低S/Co比值阳性*RIBA HCV检测或阳性报告阴性报告不确定报告阳性阴性RIBA HCV检测HCV RNA的检测阳性报告阴性报告不确定报告报告*以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)为“界值”。CDC抗-HCV实验室检测结果报告导则丙肝病毒抗体38ANA ENA 测定目前临床应用检测自身抗体的主要免疫学试验技术种类有：间接免疫荧光法（indirect immune fluorescence, IIF）、直接免疫荧光法(IF)、酶联免疫吸附试

17、验（ELISA）、免疫印迹技术、乳胶颗粒凝集、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫检验和酶免疫细胞化学等。其中，IIF法、免疫印迹法和ELISA法被广泛用于临床检测直接抗细胞成份和可溶性细胞成份抗体的检测。有时为了弥补试验技术或试剂中可能存在的缺陷以及试验条件的影响，提高试验结果的特异性和敏感性，也用一种方法检测多种自身抗体，或一种自身抗体用多种试验方法检测 。39ANA.ENA-Abs40欧蒙斑点法(EuROAssAY) 实验原理 将膜条上平行包被数种纯化的、已鉴定生化特性的抗原线作为固相。象固定生物薄片一样将膜条固定在载片的反应区。 若是阳性，已稀释血清中的特异性抗体将与固相上的抗原结合。 第二步

18、，碱性磷酸酶(AP)标记的抗人抗体与已结合的抗体反应。 第三步，加入可产生颜色反应的色原底物溶液温育。若标本中含有待测的特异性抗体，相应的抗原条带将呈现较深的颜色。ANA.ENA-Abs41结果判断简单，可靠 不需特殊仪器，肉眼判断结果 由于把抗原包被在固定的位置判断实验结果比免疫印迹法简单，更适合常规检测 反应区的质控带呈显较深的颜色反应说明操作正确。 阴阳性结果差别明显。条带显色的深浅与抗体滴度相关。 抗原经亲和层析分离纯化。膜条上没有多余蛋白，不会产生非特异性反应。 反应过的载片可长期保存，试验结果容易存档。ENA多肽抗体谱（欧蒙斑点法）ANA.ENA-Abs42ENA多肽抗体谱（免疫印

19、迹法）ANA.ENA-Abs43需注意问题 (1)同一批号NC膜与同一批号标准带相比：了解了NC膜制备可知只有同一批号才有比较价值，因在一次电泳中各种ENA抗原泳动位置相同，不同批号时因每每电泳条件不可能完全一致而没有可比性；电泳中蛋白质迁移率衡定，各种蛋白质先后顺序衡定，但各蛋白质之间距离(mm)因每次电泳条件不同而有变化。 (2)标本膜条“O”线与标准带“O”线对齐：有时病人血中仅含有一种单抗原区带显色的ENA抗体甚或一种非特异显色区带，如果没有将“O”线对齐，12mm的偏差就会误判为另一种ENA抗体或误为非特异显色而报出错误的报告。 ANA.ENA-Abs44关于标准带的误差 理论上同一分子量的蛋白质在一次电泳中泳动速度是一致的，从“O”线至电泳位置的距离是一样的；实际上，一整块聚丙酰胺凝胶电泳时虽蛋白质同起于“O”线，但两边蛋白质因各种因素的作用而速度有变，使在整块凝胶上两边蛋白质呈一条弧线，厂家在切制NC膜条时应将周边误差部分切除，但有时仍有余留。这余留部分就会造成标准带的误差，检验人员在观察结果时应注意这一问题。IBT同EL