qPCR技术概述课件

1、qPCR技术概述第1页，共45页。目录第一部分：RNA提取RNA的重要性RNA提取的方法RNA质量的鉴定第二部分：荧光定量 荧光定量的原理和方法 荧光定量的应用 市场上常见的荧光定量产品2022/8/202第2页，共45页。2022/8/203从RNA开始到基因拷贝数的定量或者表达研究，已经成为大多数实验的主流设计方案，也是RNA相关课题研究的首选思路。完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、RNA芯片，mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。1. RNA提取的重要性第3页，共45页。2022/8/2041. RNA提取的重要性

2、第4页，共45页。2. RNA提取方法2022/8/205细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂（ SDS、胍盐等),迅速破坏细胞结构，抑制RNA酶的活性，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。 通过有机溶剂（酚、氯仿 等）处理可以使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。第5页，共45页。2. RNA提取方法2022/8/206欲提取RNA的样本释放出RNA 得到纯化的总RNA 对RNA保存异硫氰酸胍，胍盐/-巯基乙醇等，对细胞进行裂解有机溶剂或硅基质吸附等方法对RNA进行纯化第6页，共45页。2. RNA提取方法样品准备2022/8

3、/207样本最好用新鲜或者速冻(不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中)的没有经过反复冻融的样本。样品预处理方式：不同来源的样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织、细胞等）因细胞结果不同预处理方式亦有所不同。一般处理方式如下： 植物材料液氮研磨 动物材料匀浆(液氮条件下)、液氮研磨 细菌溶菌酶破壁第7页，共45页。2. RNA提取方法细胞裂解异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）:TRIzol方法，Invitrogen公司最先开发，应用于大部分动植物材料，但对次生代谢较多的植物材料，RNA提取效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中。而酸性苯酚可促使RNA进入水相

4、，离心后可形成水相和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。2022/8/208基因组DNA水相有机相RNA第8页，共45页。2. RNA提取方法细胞裂解 胍盐/-巯基乙醇法： Qiagen公司最先开发,此方法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。胍盐使细胞充分裂解，-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程可以抑制RNase的活性，保护RNA不被降解2022/8/209第9页，共45页。2. RNA提取方法细胞裂解2022/8/2010其他方法：有些植物材料多糖多酚，如植物果实，番茄叶子等；有些植物木质化程

5、度较高，如根茎等组织，这些都会导致RNA提取过程的困难。如：纤维组织（心脏，骨骼肌等）由于这些组织细胞密度低，单位重量组织中RNA含量低，所以需要增加起始量。蛋白/脂肪含量高的组织（脑，油菜，菜籽等）如果抽提后上清含白色絮状物，需要重新抽提。第10页，共45页。2. RNA提取方法纯化2022/8/2011纯化原则：消除RNA样品中存在的对酶（如逆转录 酶）有抑制效应的有机溶剂和高亮度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖、脂类分子的污染。排除DNA分子的污染第11页，共45页。2. RNA提取方法纯化有机溶剂抽提法抽提：常用氯仿，以去除蔗糖、蛋白等杂质沉淀：用异丙醇或乙醇来沉淀水相中的

6、RNA洗涤：75%的乙醇洗涤，去除盐离子溶解：加入适量的RNase-free ddH2O2022/8/2012第12页，共45页。2. RNA提取原理纯化硅基质吸附法 利用核酸与硅基质材在高盐条件下结合，低盐条件下脱离的特征。2022/8/2013第13页，共45页。3.RNA评价与鉴定 提取RNA后我们需要对RNA进行相关的质量检测， 以确定它是否符合后续试验的要求。RNA用于不同的后续试验，对其质量要求不尽相同。如：cDNA文库构建：要求RNA完整，且无酶抑制物残留Northern blot ：对RNA的完整性要求高RT-PCR:对酶反应抑制物残留要求严格2022/8/2014第14页，共

7、45页。3.RNA评价与鉴定RNA纯度检测分光光度计法通过OD260/280来检测RNA的纯度，OD260/230作为参考OD260/280在1.9-2.1之间，可以认为RNA的纯度较好；OD260/280小于1.8，则表明蛋白质杂质较多；OD260/280大于2.2，则表明RNA已经降解；OD260/230小于2.0，表明裂解液中有异硫氰酸胍和-疏基乙醇的残留。2022/8/2015第15页，共45页。3.RNA评价与鉴定 rRNA占总RNA的80%-85%，在琼脂糖凝胶上可以清晰的看到28S(23S)和18S（16S）rRNA。当28S rRNA的量约为18S rRNA的两倍的 时候，说明

8、RNA的完整性较好2022/8/2016 RNA完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳第16页，共45页。第二部分：实时荧光定量PCR2022/8/2017在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。 第17页，共45页。1.qPCR原理和方法2022/8/2018实时荧光定量PCR是1996年由Applied Biosysrems 公司推出的实验技术；常用的荧光标记方法：1，非特异性荧光标记（染料法）： 1、SYBR Green 2、EvaGreen 3、LC Green2，特异性荧光标记（探针法）： 1、TaqMan 2、

9、Molecular Beacon 3、Amplisensor第18页，共45页。1.qPCR原理和方法SYBRB Green基本原理: SYBR Green I是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。只有和双链DNA结合后才发荧光，当DNA双链分开，无荧光。 2022/8/2019SYBR Green第19页，共45页。SYBR GREEN法优缺点优点：对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏 便宜缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性（但可以通过溶解曲线的分析优化反应条件）对引物特异性要求较高2022/8/20201.qPCR原

10、理和方法SYBRB Green第20页，共45页。1.qPCR原理和方法SYBR Green熔解曲线分析利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。2022/8/2021SYBR GREEN 熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确第21页，共45页。1.qPCR原理和方法SYBR Green 熔解曲线分析2022/8/20221，融解曲线分析，有杂峰；2，其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确。第22页，共45页。1.qPCR原理和方法Taq man探针法5端标

11、记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针2022/8/2023第23页，共45页。1.qPCR原理和方法Taq man探针法2022/8/2024第24页，共45页。1.qPCR原理和方法Taq man探针法2022/8/2025Taq man探针法优缺点：优点：对目标序列高特异性-阴性结果确定设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标价格较高不容易找到本底低的探针第25页，共45页。1.

12、qPCR原理和方法Molecular Beacon 分子信标2022/8/2026分子信标是一段荧光标记、具有茎环发夹结构的寡聚核苷酸探针环两端各有5-6个核苷酸配对形成茎环结构，5端报告基团，3端淬灭基团在PCR反应的退火/延伸阶段，分子信标与靶序列特异结合，分子信标由发夹结构变为链状结构第26页，共45页。1.qPCR原理和方法Taq man探针法2022/8/2027Taq man探针法优缺点：优点：对目标序列高特异性 检测SNP最灵敏的试剂之一。荧光背景低缺点：只适合一个特定的目标价格较高不容易找到本底低的探针第27页，共45页。2.qPCR原理和方法 定量原理2022/8/2028第

13、28页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2029Fluores cence第29页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2030Ct值的定义：CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。CT值由阈值确定第30页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2031阈值(threshold) 缺省值设定为基线（baseline，即本底信号）范围(3-15个循环)内荧光信号强度标准偏差的10倍。阀值由基线确定第31页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理20

14、22/8/2032理想的PCR反应: XnX0 * 2nXn ：第n次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量n ：扩增循环数第32页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2033非理想的PCR反应: XnX0 * (1+En)n Xn：第n次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量n： 扩增循环数En: 扩增效率第33页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2034在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M - (1)XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: lg

15、 M=lg X0(1+Ex)*Ct-(2)整理方程式(2)得: lg X0= -Ctlg(1+Ex) + lg M- (3)扩增产物的对数与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。第34页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2035荧光强度-循环数曲线初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线10410310610510210浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量第35页，共45页。2.qPCR原理和方法定量原理绝对定量 目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，

16、需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。相对定量 不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方法是通过稀释目的基因的PCR产物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。2022/8/2036第36页，共45页。绝对定量2022/8/2037敏感性高: 检测低拷贝数样品;区分小差异样品大范围拷贝数样品同时检测: 100 1010省时有效临床检测，转基因检测环境监测等第37页，共45页。标准曲线法相对定量举例2022/8/2038第38页，共45页。标准曲线法相对定量举例2022/8/20

17、39设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化：靶基因拷贝每一个内标基因拷贝 双标准曲线法 含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线； 样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理， 标本间靶基因的表达水平分析 2 -c(t) 法 标本内靶基因与内标基因Ct值比较： C(t) =C(t)m- C(t)n 标本间C(t) 比较： c(t) C(t)1-C(t) 2 -c(t) 计算第39页，共45页。标准曲线法相对定量举例2022/8/2040第40页，共45页。标准曲线法相对定量举例2022/8/2041第41页，共45页。3. qPCR的应用1，定量分析2，定性分析2022/8/2042第42页，共45页。3.qPCR的应用定量分析绝对定量分析：DNA 或 RNA 的绝对定量分析 病原微生物或病毒含量的检测 ,转基因动植拷贝