DB34-T 4203-2022 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程

1、ICS11.220CCSB 41ICS11.220CCSB 41安徽省地方标准DB34/T42032022猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程Regulation for detection of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from swine20222022062920220729安徽省市场监督管理局发 布DB34/T 4203DB34/T 42032022前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 I I DB34/T 4203DB34/T

2、42032022DB34/T 42032022麦康凯培养基（MAC）：按照 GB 4789.6 规定执行。革兰氏染色液：按照 GB 4789.41 规定执行。 三糖铁（TSI）琼脂斜面培养基：按照 GB 4789.6 规定执行。蛋白胨水和靛基质试剂：按照 GB 4789.6 规定执行。 缓冲葡萄糖蛋白胨水和甲基红试剂、V-P 试剂：按照 GB 4789.38 规定执行。枸橼酸盐培养基：按照 GB 4789.38 规定执行。 LB 固体培养基：见附录A 中 A.3。 试验小鼠：68 周龄，体重 18 g22 g，清洁级。 大肠杆菌 O 抗原单因子标准血清。 DB34/T 42032022麦康凯培

3、养基（MAC）：按照 GB 4789.6 规定执行。革兰氏染色液：按照 GB 4789.41 规定执行。 三糖铁（TSI）琼脂斜面培养基：按照 GB 4789.6 规定执行。蛋白胨水和靛基质试剂：按照 GB 4789.6 规定执行。 缓冲葡萄糖蛋白胨水和甲基红试剂、V-P 试剂：按照 GB 4789.38 规定执行。枸橼酸盐培养基：按照 GB 4789.38 规定执行。 LB 固体培养基：见附录A 中 A.3。 试验小鼠：68 周龄，体重 18 g22 g，清洁级。 大肠杆菌 O 抗原单因子标准血清。 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程范围 本文件适用于猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定。 （ GB

4、 4789.6GB 4789.38GB 4789.41 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 肠外致病性大肠杆菌 extraintestinal pathogenic SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 肠外致病性大肠杆菌 extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC 4 主要设备和材料显微镜：10100。 电子天平：感量 0.1 g。 恒温培养箱：

5、37。冰箱：04。 无菌培养皿：直径 75 mm 或 90 mm。 无菌试管：12 mm100 mm，15 mm150 mm。麦氏比浊管。 pHpHpH和氯化钠溶液：见附录AA.1 30甘油缓冲盐水溶液：见附录 A 中 A.2。 1 5 操作规程 ExPEC分离鉴定的流程示意图见附录B。 30 甘油缓冲72 （04）培养 18 h24 （菌1.0 mm2.5 mm）18 h24 （TSI）37 培养 18 h24 h。H2S37 培养 18 h24 h，（I）（MR）、V- P（Vi）（C）IMViCIMViC4789.38、GB 4789.6取1055.2.30.50.3 mL鼠每只腹腔注射

6、 0.3 mL3 d 内小鼠精神状况及死亡情MAC，37 培养 24 h2 TSMViExPEC。 O见附录C。见附录D。 5.2.2，5.2.3，5.2.4，ExPEC 6.15.2.5，OExPCE 6.15.2.6，ExPCE 应按照 GB 19489、SN/T 2984 和 SN/T 2025 的规定执行。 3 3 DB34/T 4203DB34/T 42032022DB34/T 4203DB34/T 42032022附 录 A（） 成分氯化钠38.0 g39.0 蒸 馏 水 100 mL 制法将 38.0 g39.0 g 氯化钠加入 100 mL 蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后

7、，分装于采样管，每管 5 mL10 mL，121 高压灭菌 15 min 备用。 30成分氯化钠0.5 中 性 甘 油 30 mL 蒸 馏 水 100 mL A.2.2 制 法5 mL10 15 min 备用。 LB中 性 甘 油 30 mL 蒸 馏 水 100 mL A.2.2 制 法5 mL10 15 min 备用。 LB成分胰蛋胨10.0 酵母取物5.0 氯化钠10.0 琼脂15.0 g20.0 蒸 馏 水 1000 mL 制法将 A.3.1 中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至 7.40.2，121灭菌 20 min，待冷却至50 左右时倾注平板。 4 图B.1 图B.15 附

8、录 B（资料性）猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定流程见图B.1。 检 样 麦康凯培养基分离培养 （菌落呈鲜红色或粉红色，中等大小，直径 1.0 mm2.5 mm，圆形，边缘整齐，表面光滑） 选取可疑菌落涂片镜检、纯培养 检 样 麦康凯培养基分离培养 （菌落呈鲜红色或粉红色，中等大小，直径 1.0 mm2.5 mm，圆形，边缘整齐，表面光滑） 选取可疑菌落涂片镜检、纯培养 （革兰氏阴性直短杆菌，两端钝圆，无芽孢，多散在，也有成对排列） 生化试验 （TSI：面底均或变，气产H2SIMViC + + 肠外大肠杆菌 动物试验 OPCR 肠外致病性大肠杆菌 系统进化群 PCR 鉴定 结果报告 附 录 C（资

9、料性）猪肠外致病性大肠杆菌 O 抗原血清型鉴定ExPECO将ExPECLB37 培养 18 h24 h，用 3mL 0.5121 高压灭菌 2 hKO抗原，储存于 备用。 ExPECO取O抗原分别与大肠杆菌的O抗原单因子血清进行玻片凝集反应。即O抗原和O抗原单因子血清各取15 L 在玻片上混匀，2 min 内出现明显凝集者为阳性反应。同时以O抗原与 0.5 石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象。玻片凝集试验判定标准见表C.1。表C.1 玻片凝集试验判定标准反应强度 判断依据 对应结果 + 液体完全透明，出现大的凝集块 阳性 + 液体几乎完全透明，有明显凝集块 阳性 + 液体不甚透明，

10、有可见凝集块 阳性 + 液体浑浊，有小的颗粒状物 阴性 - 液体浑浊，无凝集现象 阴性 ExPECO1:640O器加入 0.5mL 0.5 石炭酸生理盐水。用移液器吸取 1:10O mL168mL20.5 mL3770.5 mL8171:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280； 0.5 mL O 37 水浴锅 4h （以“” “”，100“”75 6 “”，50 “”25 “” 7 7 附 录 D（资料性）猪肠外致病性大肠杆菌系统进化群 PCR 鉴定PCR1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR2PCR Master Mix、超纯水、琼脂糖、10mg/ML

11、溴化乙锭（EB）、TBE 缓冲液、上样缓冲液（10Loading Buffer）、相对分子质量Marker（DL-2000）。猪肠外致病性大肠杆菌系统进化群PCR鉴定用引物见表D.1。 ExPECExPECDNA采用煮沸法。即取 1 mL 培养 20 h 的新鲜菌液加入 1.5 mL 离心管中，以 12000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入 50 L 超纯水混均，置沸水中煮沸 10 min，之后冰浴 5 min，再煮沸 5 min， 以 12000 r/min 离心 5 min，取上清液即为DNA模板。 ExPECPCR扩增AB1B2D PCR25L12.5L 的 PCRMaste

12、rMix，10mol/L上、下游引物各 1 L，1 g/L DNA 模板 2 L，灭菌超纯水 8.5 L。 PCR94 5min 94 4560 4572 50环 35 次；725min。 D.2.3 PCR8 检测基因引物名称引物序列（5-3）片段长度（bp）chuAchuA-FchuA-RGACGAACCAACGGTCAGGATTGCCGCCAGTACCAAAGACA279yjaAyjaA-FyjaA-RTGAAGTGTCAGGAGACGCTGATGGAGAATGCGTTCCTCAAC211TspE4.C2TspE4.C2-FTspE4.C2-RGAGTAATGTCGGGGCATTCACGCGCCAACAAAGTATTACG152用 100 mL1TAE1.0