粤东地区橄榄种质资源遗传多样性的ISSR分析

1、粤东地区橄榄种质资源遗传多样性的ISSR分析论文导读:：橄榄Canariumalbum.L。其遗传多样性水平也缺乏科学有效的评估。分析和电泳检测。对该地区橄榄种质资源一直缺乏系统的研究。关键词：橄榄，遗传多样性，ISSR，种质资源橄榄Canarium album.L，属于橄榄科(Burseraceae)橄榄属(Canarium)，是我国南方重要的亚热带水果。其果实营养丰富，鲜食或加工均可，是卫生部批准的药食两用果品之一。粤东地区具有悠久的橄榄栽培历史并且保存了众多优质橄榄品种，当地至今仍保存着大量树龄达数百年的橄榄古树。但是，对该地区橄榄种质资源一直缺乏系统的研究，其遗传多样性水平也缺乏科学有

2、效的评估；同时粗放的种植和管理，导致一些优良的品种或特有的农家品种正逐渐减少或消失。因此，亟待开展相关的研究和保护。近年来，随着PCR技术的开展，涌现出多种基于PCR的分子标记技术，并被广泛应用于植物种质资源亲缘关系以及遗传多样性的研究。其中，由Zietkiewicz等【1】提出的基于PCR的单引物ISSR(InterSimple Sequence Repeat)分子标记技术已在植物亲缘关系分析、遗传多样性分析、遗传图谱的构建【6】等方面广泛应用。DNA分子标记技术也被引入对橄榄的研究，如聂珍素【7】利用RAPD技术分析福建局部橄榄种质的亲缘关系；宋亚娜通过ITS序列对14份福建橄榄进行鉴定和

3、分类。本研究利用ISSR 标记技术对粤东地区64份橄榄种质的遗传多样性进行较为全面的调查研究以及评估，以期为该地区橄榄种质资源保护管理、核心种质建立以及进一步的育种方案提供相应的理论依据。1. 材料和方法1.1 材料来源试验样品采集自粤东地区(汕头市、潮州市、揭阳市和梅州市)，共计64份橄榄(Canarium album.L)种质(见表1)。采样时摘取无损伤的叶片，放入封口袋并用硅胶枯燥保存。1.2 主要试剂和仪器1.3 橄榄DNA提取橄榄基因组DNA提取采用改进的CTAB法，并用DNA纯化试剂盒对DNA原液做进一步纯化，具体步骤如下：1取0.1克左右的材料置于陶瓷研钵中并参加液氮，充分研磨，

4、成粉末状。2往研钵中参加65预热的2xCTAB提取缓冲液，将粉末状的材料研磨成匀浆并转入1.5ml离心管中，再参加适量的巯基乙醇，充分混匀，在65水浴中保温30-40min，期间不时摇动混匀。3将离心管中的匀浆分装到两个1.5ml离心管中，参加等体积的氯仿-异戊醇，充分混匀，室温静置5min，室温下10000r/min离心10min。4重复步骤3一次或两次。5取上清液加2-2.5倍体积的无水乙醇，小心摇动，出现沉淀，得粗DNA。短时离心后倒掉上清液，于沉淀中加1mol/L NaCl 400L，待沉淀溶解后，加等体积氯仿:异丙醇(24:1)，摇匀，室温静置5min，室温下10000r/min离心

5、10min。6去上清加2-2.5倍体积的无水乙醇，小心摇动，使DNA沉淀。7短时离心去除上清，参加70%乙醇洗涤沉淀、风干。8将DNA溶解于100lTE缓冲液，待DNA完全溶解后再用快速纯化试剂盒对DNA溶液进行纯化。9用1.0%琼脂糖凝胶电泳1xTAE检测总DNA的质量，利用Biophotometer 生物分光光度计(德国 Eppendorf公司)测定DNA纯度和浓度，最后将DNA保存在-20冰箱里备用。表1 供试橄榄种质材料Table 1 Canarium album accessions used for this study 编号Code 品种Cultivar 采集地Locality

6、1 果树所1号Guoshu No.1 潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong 2 果树所2号Guoshu No.2 潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong 3 果树所3号Guoshu No.3 潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong 4 果树所4号Guoshu No.4 潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong 5 马岗1号Magang

7、 No.1 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 6 马岗2号Magang No.2 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 7 马岗3号Magang No.3 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 8 马岗4号Magang No.4 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 9 马岗5号Magang No.5 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 10 马岗6号Magang No.6 潮州市饶平县 R

8、aoping Chaozhou city Guangdong 11 东山1号Dongshan No.1 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 12 东山3号Dongshan No.3 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 13 东山5号Dongshan No.5 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 14 锡1号Xi No.1 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 15 鸣2号Ming No.2 潮州市饶平县 Raoping Chaoz

9、hou city Guangdong 16 小丁香Xiaodingxiang 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 17 香种Xiangzhong 潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong 18 黄都Huangdu 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 19 下院Xiayuan 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 20 烈火Liehuo 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 21 三棱Sanleng

10、潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong 22 青皮Qingpi 潮州市湘桥区 Xiangqiao Chaozhou city Guangdong 23 西土Xitu 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 24 鸡心Jixin 汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong 25 三棱Sanleng 汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong 26 土纳 Tuna 汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong 27 甜种 Ti

11、anzhong 汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong 28 纳种 Nazhong 汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong 29 土甜 Tutian 汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong 30 小黄仔 Xiaohuangzai 潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong 31 老鼠牙 Laoshuya 潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong 32 下赤 Xiachi 潮州市潮安县 C

12、haoan Chaozhou city Guangdong 33 大普 Dapu 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 34 细粒 Xili 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 35 双湖香榄 Shuanghuxiang 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 36 赤种仔榄 Chizhong 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 37 揭西赤榄 Jiexichi 揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong 38 普

13、宁甜种榄 Puningtian 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 39 广太青皮榄 Guangtaiqing 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 40 普宁鸡心榄 Puningjixin 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 41 大池甜榄 Dachitian 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 42 铁节榄 Tiejie 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 43 冬节园1号 Dongjieyuan No.

14、1 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 44 冬节园2号 Dongjieyuan No.2 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 45 盐埕赤榄 yanchengchi 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 46 凤湖榄 Fenghu 揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong 47 麒麟纳种 Qilin 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 48 揭西青皮 Jiexiqingpi 揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang

15、 city Guangdong 49 大纳种榄 Dana 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 50 赤种榄 Chizhong 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 51 铁条榄 Tietiao 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 52 车酸1号 Chesuan No.1 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 53 东联香榄 Donglianxiang 梅州市丰顺县 Fengshun Meizhou city Guangdong 54 大甜种 Dat

16、ian 梅州市丰顺县 Fengshun Meizhou city Guangdong 55 凤喜赤 Fengxichi 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 56 四季榄 Siji 揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong 57 蟹目榄 Xiemu 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 58 鸿运榄 Hongyun 揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong 59 广太甜榄 Guangtaitian 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangd

17、ong 60 杂赤榄 Zaichi 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 61 澄皮榄 Chengpi 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 62 大纳甜种 Danatian 揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong 63 大红心榄 Dahong 揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong 64 双罗 Shuangluo 潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong 1.4 ISSR分析和电泳检测ISSR引物序列参照UBC引物set

18、#9(University of British Columbia, Canada)，从随机选取的48个引物中筛选出8个能够获得清晰条带、重复性高的引物用于此次分析。采用20L反响体系，其中包括2L10 xPCR buffer，Mg2+ 3.0mmol/L，dNTP 0.225mmol/L，Taq DNA 聚合酶1U，模板DNA80ng和引物0.25mol/L。PCR扩增在Biometra T-personal型PCR仪(德国Biometra公司)上进行，扩增程序为：94预变性4min；30个循环，每个循环94变性1min，49退火1min，72延伸1.5min；72延伸8min；最后4保存。

19、PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳别离，凝胶中含0.5g/mL EB，电极缓冲液为0.5xTBE，电压为2.5V/cm，以100bp DNA Ladder Marker作为标准分子量对照。电泳结束后使用Gene Genius 凝胶成像系统(英国Syngene公司)拍照。PCR反响重复3次。1.5 数据处理电泳图谱上同一位点处有清晰、重复出现电泳条带记为1;，无条带、弱带或重复性差记为0;，形成原始数据矩阵。利用NTSYS-pc 2.10e 软件，根据Dice算法计算种质之间的相似性系数，并进行聚类分析和主坐标分析。对聚类结果和相似性矩阵进行Mantel相关性检验。利用POPGENE32计算利

20、Shannons信息指数(I)、有效等位基因数(Ne)、观察等位基因数(Na)和Neis基因多样性(H)等遗传多样性指数。2. 结果与分析2.1 ISSR分析8条引物对64份种质进行ISSR扩增，总共获得128个条带，其中多态性条带99条，多态性比率为77.34%(见表2、图1)。每个引物产生13-19条谱带，平均每个引物产生16条谱带。每个引物可得到7-17条多态性条带，平均每个引物产生12.4个多态性标记。说明ISSR分子标记技术可以在橄榄种质分析中获到丰富的信息量。图1 引物UBC-840对64份材料的扩增结果电泳图谱Fig. 1. Amplified profiles of 64 te

21、st accessions by using primer UBC-840注：164 为样品编号见表1；M: DNA MarkerNo.164 are the accessionsnumber in table 1；M showed 100bp DNA Ladder Marker表2 8个ISSR引物对64份橄榄种质的扩增结果Table 2 8 ISSR primers and theirs amplified bands in 64 accessions of Canariumalbum 引物 Primer 引物序列(5-3) Sequnence of primers 扩增条带数 Numbe

22、r of amplified bands 多态性条带数 Number of polymorphic bands 多态性比率(%) Percentage of polymorphic bands(%) 836 (AG)8YA 16 12 75.00% 840 (GA)8YT 13 7 53.85% 841 (GA)8YC 18 15 83.33% 886 VDV(CT)7 13 11 84.62% 887 DVD(TC)7 19 17 89.47% 888 BDB(CA)7 15 12 80.00% 889 DBD(AC)7 19 16 84.21% 891 HVH(TG)7 15 9 60.0

23、0% 总计Total 128 99 平均Average 16 12.4 77.34% 2.2 遗传相似性分析根据数据矩阵利用Dice法计算种质间的相似性系数。由结果可知，64份橄榄种质之间遗传相似性系数范围是0.5714-0.9379，平均遗传相似性系数为0.7793；遗传相似性最低的是马岗6号和鸡心，相似性系数为0.5714，冬节园1号和冬节园2号遗传相似性最高，为0.9379。2.3 聚类分析根据64份种质间的遗传相似性系数，采用UPGMA法构建树状聚类图(见图2)。聚类结果，在相似性系数为0.768处将64份橄榄种质分为5簇。第1簇包括广太青皮榄等48份种质；第2簇包括青皮等8份种质；第

24、3簇仅有细粒1份种质；第4簇包括黄都等4份种质；第5簇包括下院等3份种质。从聚类结果可见，64份橄榄材料未出现依据材料种植区域分组的情况。如，同样说明供试材料并没有明显的地域性，这可能与各地相互引种栽植有关。但也有种植区域相同而聚类时聚在一起的。如都分别聚在一起，后两者之间遗传相似性达0.9379，说明这2个种质间亲缘关系很近，遗传相似性程度高，它们可能具有相同的亲本，或可能其中之一是另一种质的变异品系。将UPGMA 法得到的聚类结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行Mantel 检验。结果说明，2 种矩阵极显著相关，相关系数为0.8055，说明聚类结果较好地表达了种质之

25、间的遗传关系。图2 64份种质ISSR标记聚类图Fig.2 Dendrogram for 64 accessions based on ISSR markers注：164 为样品编号No.164 are the accessionsnumber in table 12.4 主坐标分析为了进一步分析种质之间的关系，根据相似性矩阵对64份种质进行主坐标分析，前三个主坐标解释的变异分别为78.43 %、3.27%和1.71%，根据第一、二坐标对64份种质进行排序(见图3)。从主坐标图中可以较明显的看出64份橄榄种质在第一、二坐标排序中分成5个类群，第类群包括44份种质，均包括其中5份种质另外3份材料

26、其中3份种质2份种质1份种质其中2份种质2份种质两种分析方法虽然存在分歧，但是结果根本一致。此外，利用两种不同方法分析种质间的关系，有利于从多个角度分析种质之间的关系，从而有助于更进一步的分析。图 3 64份种质依据ISSR分析的主坐标散点图Fig. 3The scatter plot of pricipal coordinate analysis of 64 accessionsbased on ISSR markers注：164 为样品编号见表1：汕头市潮阳区；：潮州市；：揭阳市；：梅州市No.164 are the accessionsnumber in table 1: Chaoyan

27、g district of Shantou City;: Chaozhou City;:JieYang City;:MeiZhou City3. 讨论3.1 橄榄ISSR的多态性以往的研究说明，ISSR揭示的多态性一般都比RAPD高。但是也出现RAPD揭示的多态性高于ISSR的，如Archak等以及Hidetoshi Ikegami等的报道。聂珍素用RAPD技术对福建橄榄进行分析，得到99.5%的多态性【7】。在本研究中， ISSR揭示的多态性为77.34%，虽然低于聂珍素【7】的分析结果，但仍显示出丰富的多态性，同时64份橄榄之间的遗传差异也被区分开来，证实了ISSR分子标记可以有效的应用于

28、橄榄种质资源亲缘关系的分析。至于粤东地区与福建橄榄种质资源遗传多样性的差异，目前尚不清楚，还需后续进一步将两地资源置于同一条件下进行分析比拟。3.2 粤东地区橄榄遗传多样性本研究的结果说明，粤东地区橄榄种质遗传多样性水平较低，这可能与所用材料的来源地比拟集中有关。来源地相对集中，使不同品种之间基因交流的可能性增大，遗传多样性水平降低，还表现为系统聚类结果未出现依据材料种植区域分组的现象。在Thimmappaiah等的研究中也有类似的结果，作者认为这可能是杨本超等在研究烤烟种质遗传多样性时指出，地理位置相近的材料其遗传相似性虽然较高，但是并不表现出类群和地理位置的密切相关。由结果分析还发现，粤东

29、地区橄榄种质存在同名异物现象。如三棱和三棱，农艺性状极为相似，在生产中被视为同一品种，但在核酸水平上却存在较大差异；又如3份同样以青皮命名的橄榄广太青皮榄(普宁)、揭西青皮(揭阳)和青皮(潮州)，并未表现出预期那样高的遗传相似性。说明通过ISSR分析，可以更准确地揭示品种间的亲缘关系，把历史上或地域上由于命名而混淆的一些品种区分开来。3.3 聚类分析和主坐标在本次研究中采用系统聚类分析和主坐标分析对64份种质之间的亲缘关系进行分析，从结果上看，虽然这两种分析方法的结果存在一些分岐，但是整体是一致的。在两种分析方法中，聚类分析中的第1簇和主坐标分析中的第类群根本一致。此外，在两种分析中细粒均单独成类，这也说明该品种和其它品种间的亲缘关系相对较远。同时使用两种分