微生物代谢工程复习

1、微生物代谢工程复习提纲第一章绪论代谢工程定义、主要研究内容及应用方向1、代谢工程定义：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性,或运用重组DNA技术来创造新的化合物。2、主要研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作。3、应用方向：提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物；优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。4、要解决

2、的主要问题：改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不同途径中的流量分布。典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物的最大转化率。5、代谢工程最为突出的特征是强调生化反应途径与代谢流及其体内条件的控制相关联。6、代谢工程的首要工作就是利用在广泛而深入的研究中获得的技术信息进行组合设计。系统研究代谢流及其控制机制包括的三大基本步骤1、建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测定其流量的方法。为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进行简单的物料平衡。由于一个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性，所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的代谢流信息

3、，除非相应的酶在体外分析条件下存在并具有活性。因此，在代谢分析中，酶法分析常会错误地显示相似数量级的代谢流，从而导致产生不正确的结论。2、在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统松散之后达到新的稳态时的代谢流。常用的扰动方式包括启动子的诱导、底物流加、特定碳源消除或物理因素变化等。虽然任何有效的扰动对代谢流的作用都是可以接受的，但扰动必须定位于近邻途径节点的酶分子上。一种扰动往往能提供多个节点上的相关信息，这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是至关重要的。3、要系统分析代谢流扰动的结果。如果某个代谢流的扰动对下游代谢流并未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游的扰动

4、是刚性的，相反则成为柔性的。一般地，在刚性节点处，不能通过改变上游酶活性来影响下游代谢流。节点、柔性节点、强刚性节点、弱刚性节点、依赖型代谢网络、独立型网络、代谢流分析、弹性系数、流量控制系数。1、节点：网络分流处的代谢产物称为节点。2、柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。3、强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。4、弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或

5、对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。（柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象）5、依赖型代谢网络：如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称为依赖型代谢网络。依赖型代谢网络的存在会给代谢工程的实施带来很大的困难。独立型代谢网络：如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网络为独立型网络。6、代谢流分析：代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡计算细胞内的代谢流。（放射性标记、同位素示踪技术）7、弹性系数和流量控制系数

6、是代谢控制分析研究的两个主要指标。弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速率的影响程度。流量控制系数则为单位酶变化量引起的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡量某一步酶反应对整个反应体系的控制程度。这两个系数相互关联，可直接或间接测定。阐述代谢工程研究方法和技术主要的三大常用手段代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。因此,在研究方法和技术方面主要有下列三大常用手段：（1）检测技术常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分析方法；测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学方

7、法（核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。分析技术在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造的思路。这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组合法以及代谢网络优化技术等。基因操作技术在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几乎所有的分子生物学和分子

8、遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA在细胞内的稳定维持等。代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种(包括人体)中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发。论述代谢改造常用三大思路及代谢设计原理代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。改变代谢途径方法：一是加速限速反应即增加限速酶的表达

9、量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。二是改变分支代谢途径流向，即提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。扩展代谢途径：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。代谢设计原理一、在现存代谢途径中改变目的产物代谢流增加目的产物代谢流从以下方面入手：1、增加限速酶编码基因的拷贝数2、强化以启动子为主的关键基因的表达系

10、统3、提高目标途径激活因子的合成速率4、灭活目标途径抑制因子的编码基因5、阻断与目标途径相竟争的代谢途径6、改变分支代谢途径流向7、构建代谢旁路大肠杆菌糖代谢未端产物乙酸能抑制菌体的生长，应用代谢工程的方法将枯草芽抱杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢旁路，结果能明显的降低细胞中的乙酸浓度，使乙酸始终处于较低的水平。8、改变能量代谢途径将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且也可以促进蛋白和抗生素的合成。血红蛋白的作用在于在限氧条件下提高了ATP的产生效率。二、在现存途径中改变物流的性质指使手原有途径更换初始底物或中间产物，以达到

11、获得新产物的目的。可以通过以下两种方法：1、利用酶对前体库分子结构的宽容性如利用酶的相对专一性，投入非理想型初始底物参与代谢转化反应，就可以进而合成细胞原不存在的化合物。2、通过修饰酶分子以拓展底物识别范围修饰酶分子的结构域功能域，以扩大酶分子对底物的识别范围和催化范围。三、在现存途径基础了扩展代谢途径在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。四、利用已有途径转移或构建新的代谢途径在明确了已有的生物合成途径、相关基因以及各步反应的分子机制后,通过相似途径的比较，可以利用多基因间的协同作用构建新的代谢途径。1、转移多步途径以构建杂合代谢网络相关的基因如果以

12、基因簇的形式存在，往往能更便利。2、修补完善细胞内部分支途径，以合成新的代谢产物代谢物流分析方法1、黑箱模型就是将胞内反应看成是单一反应或者是整个细胞生物基质的变化，并采用物料衡算原理保证细胞内外各元素之间的平衡。在此模型中涉及的元素包括底物、代谢产物和生物基质的元素组成及其一系列进出细胞的流量。2、代谢流平衡模型在黑箱模型的基础上结合代谢网络图，便提出了代谢流平衡模型。根据代谢路径中各反应的计量关系以及实验的某些底物、产物的通量及细胞组成等确定整个代谢网络的通量分布。要得到正确的通量分布，必须清楚地了解细胞内代谢途径，尤其是各个分支点。缺少某一重要的分支或增加某一根本不存在的分支，都可能使求

13、得的通量分布有很大变化。代谢网络、通量、代谢主流、载流途径、代谢主流的变动性和选择性1、代谢网络:分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络句括物质代谢网络和能量代谢网络。2、通量：物质或信息通过途径被加工的速率。3、代谢主流：在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该条件下的代谢主流。代谢途径的延伸和剪接都可能改变代谢主流，从而实现新基质的利用和新产品的开发。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。4、载流途径：代谢主流流经的代谢途径为主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途径，即生产所需产

14、物期间让碳流相对集中流向产物合成的途径。5、代谢主流的变动性和选择性：微生物的代谢主流处于不断变化之中，其方向、流量甚至代谢主流的载流途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。代谢通量的研究方法及各自优缺点目前常用的代谢网络模型方法主要分为两类：一类是基于计量学的方法，另一类是基于动力学的方法。1动力学基于动力学的方法主要研究胞内反应速率与其影响因素如酶、代谢物浓度等之间的关系，但动力学方法都面临着的一个共同困难就是动力学信息的匾乏。许多酶动力学参数都是在胞外测得的，而

15、具体在体内正常生理状态下可能受到许多因素的影响，与胞外测得动力学特性有很大差异。另一方面，对于复杂的整体细胞代谢网络，要完全了解其代谢调控机制还有较大差距，更不用说建立定量的动力学模型，而且完全采用动力学方程描述在数学上也是一项很困难的工作。2、计量学要简单实用的多，仅需已知代谢网络中的反应方程的计量系数，即可对其进行计量关系分析。因此，计量学模型是目前比较成功的模拟方法。该方法首先要根据已标识的基因组序列、已知的生物化学知识和其它如蛋白组学数据等高通量资源，建立生物系统的代谢网络。然后，定义控制网络的约束，包括反应的计量学和热力学、酶性能和代谢物稳态质量衡算。通量平衡分析方法、多目标通量平衡

16、分析方法1、通量平衡分析方法(FBA)确定胞内代谢反应净速率，采用通量平衡分析方法(FluxBalanceAalysis,FBA)o围绕胞内代谢反应，使用物料衡算方法，对所有主要的胞内反应建立一个代谢流平衡模型，并利用该模型计算不同途径的代谢流分布，用线性代数程序求解。该计量学模型适用待定网络中只有一个目标函数的情况。这目标函数可以根据获得生产潜能、生理状态设定为：最大生物量、代谢产量或ATP产量、最小化营养物质的利用等。但是只有一个目标函数对于描述复杂的系统还有不足之处，如要在底物不断变化的条件下，在高细胞生长速率下获得理想的产率。那么只满足了一个目标函数的最优化模型并不能保证其它目标的最优

17、化。2、多目标通量平衡分析方法(MOFBA)多目标优化的结果是可以得到一个操作范围内的点/线问题。在目标函数变化范围内，如果结果是以点的形式表现，与获得变化曲线相比，一个点提供的反映多目标的协调关系的信息有限。对于复杂的多目标向量，目标函数符合线性条件下，可通过多目标线性程序获得非劣解集方法获得变化趋势曲线。产生非劣解的研究方法有：权重法，小量约束法，非劣解集估计法(NISE),多目标简化法。多目标简化法是将多目标简化为简单目标来获得劣解集，但是对大规模系统会带来大量的计算机分析负担，也不能使用通用的大规模线性代数程序分析数据，不适合于大规模的代谢工程分析。非劣解集估计法(noninferio

18、rsetestimation,NISE)是一种有效逼近非劣解的方法，此法是利用线形代数形式，将其估计之非劣解的各点之线性集合用来代表整个非劣解集合。与其它方法相比，NISE能获得更准确的估计值，只用相对较少的计算机分析，就可以获得柏拉图(Pareto)曲线。通过曲线可以找到两个目标最高的交集。物流限制作用的克服措施代谢途径存在着固有的限速步骤，它们控制着流经代谢途径的代谢物流，其主要特征表现在：限速步骤的反应速度很低，整个系统的代谢物流取决于催化该反应步骤的酶活性；限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋白合成的调节。调节方法：(a)等量提高所有酶的量(不能提高转化率)；提高限速酶的量(鉴别出具有

19、高的流量控制系数的酶比超表达个别酶往往能获得更好的结果)。反馈抑制的特征及消除措施1、反馈抑制的特征只有代谢的终产物或它的结构类似物具有反馈抑制作用；受抑制的一般是代谢途径的第一个酶；反馈抑制作用是可逆的。2、消除措施消除反馈抑制作用的主要效果在于增加代谢中间体的浓度，而对物流的影响很小。超表达单个酶不能增加代谢物流。大量研究结果表明，物流的控制分布在多个酶上，在任何情况下解除单个酶的反馈抑制作用是有限的，特别是在途径起点受反馈抑制的酶是物流控制不敏感之处，尽管它对代谢物的浓度有很大的影响。代谢物流杲中胞内酶活力调节决宗的，而不是由胞内酶活力决定的。想通过单个酶来標高代谢途径的物流是行不通的，

20、除非此酶具有很高的流量控制系数。代谢压力外源质粒的导入、重组基因的转录和表达对宿主细胞代谢造成的影响。1、外源质粒可造成的宿主细胞生长速率下降。2、仅32秒瞬间厌氧状态就会造成大肠杆菌副产物的积累和重组蛋白产量下降。3、乙酸的积累造成目标蛋白产量下降和生物量降低4、高CO?造成TCA（三竣酸循环）途径碳流量的减少，造成乙酸积累和生物量下降上述研究证明了外界环境扰动会带来的代谢流量分布的不同。也指出了可以通过控制碳代谢流操纵生产过程的观点。但目前还没有见到通过调节代谢压力操纵生产的实际应用的报导。第二章细胞代谢松弛时间近似一级反应过程的特征时间。当某反应的松弛时间比系统松弛时间长很多时，认为该反

21、应过程是冻结的。如果一个反应的松弛时间是整个系统的1/3,那么认为该反应是处于拟稳态。通过忽略在系统反应松弛时间之外的反应和代谢途径可显著简化代谢过程。糖类进入细胞的几种途径1、自由扩散化合物从胞外培养基到膜相的传递一一化合物在脂双层中扩散一一化合物从膜相到细胞质的传递以自由扩散运输的化合物：二氧化碳、氧、氨、脂肪酸和一些醇类。在解离状态时，有机酸在脂膜中实际上是不溶的，但许多未解离的有机酸是可溶解的。总的运输情况对解离程度进而对胞质和胞外培养基的PH值很敏感，对于许多生物体，穿越细胞质膜有一个PH值梯度（胞内高），这就会形成质子进入细胞的净流入。为了保持胞内质子较低的浓度，必须在消耗ATP的

22、条件下，由脂膜ATP脂酶将胞内的质子泵出去，因此有机酸的存在会导致ATP的净消耗。2、促进扩散需要载体蛋白协助运输；顺浓度梯度；无需能量消耗原核生物：甘油在大肠杆菌中的运输、葡萄糖在某些微生物中的运输真核生物：许多糖类或其它类物质的运输3、主动运输蛋白载体；逆浓度梯度；耗能初级主动运输：ATP酯酶，涉及到需要消耗ATP的质子分泌。在大肠杆菌中通过初级主动运输ATP酯酶运输的物质：组氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖和半乳糖次级主动运输：化合物的运输是与另一个化合物耦联运输的。分为同向运输（两种化合物沿同一物理方向进行运输）和反向运输（Na+、k+、Mg2+的运输属于次级主动运输）。基团转位：运输过程伴随被

23、运输物质的转化。存在磷酸转移酶系统（PTS）o来源于HMP或PP途径的氨基酸和核酸生物合成的前体物质5-磷酸核糖和4-磷酸赤薛糖是氨基酸和核酸生物合成的前体物质EMP途径中的三个代谢物：3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸在高的比生长速率下，PP途径活性增加的原因，举例说明细胞对PP途径生成的NADPH和代谢物需求的增加，尤其是RNA生物合成对5-磷酸核糖需求的增加单鋼酸己粮f相互车专库多枷合成PP（碑酸戊糖）途径濮酸己糖昇构胸糖惊异生巢糖6-磷酸葡糖脫氢酶受NADPH/NADP+的比值来调节磷酸果糖激酶则是一个复杂的别构酶，称为分析复杂代谢途径的一个中心点。该酶会受到高浓度ATP

24、的抑制，高的ATP浓度会使该酶与底物果糖-6-磷酸的结合曲线从双曲线形变为S型。而柠檬酸就是通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活性，从而使糖酵解过程减慢。受调节物2,6-二磷酸果糖的促进。与该物质的结合会导致酶对6-磷酸果糖的亲和力极大增加。因磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，因此，对此酶的调节是调节酵解作用的关键步骤。细菌乙醇代谢途径与酵母乙醇代谢途径的差别葡萄糖天冬氨酸NADH延胡索酸nh3图3.1大肠杆菌混合酸发酵量变质变量变质变丙酮酸co乙酰车甫酹乙醇图2.9酵母菌的发酵代谢-(1)丙酮酸脱氢酶；(2)丙酉同酸脱竣酶；t(3)乙醛脱氢酶；(4)乙酰辅酶A合成酶；J(5)乙醇脫

25、氢酶反.应(1在线粒体中进行”O其它反应在细胞质中进行入=i|td*u-+i=aXx丄亠r.rU工jt【匚口4t/tt、t、+f*冷岀r第三章代谢途径的调控酶的“质变”方式酶的量变”和质变”的比较调节速度慢，几小时几天快速，几秒钟几分钟调节速度慢，几小时几天快速，几秒钟几分钟能耗高（通常涉及酶基因表达,因此低（除非使用抑制蛋白，因需要消耗大量ATP）为在解除抑制的时候，通常需要将抑制蛋白水解）决定酶最高活性的主要因素酶合成与水解的相对速度已有的酶浓度活性变化持续时间酶的“质变”方式：别构调节、共价修饰、水解激活、调节蛋白的结合和解离以及单体的聚合和解离。酶活性的别构调节、共价修饰和水解激活调节

26、的异同性质别构调节共价修饰水解激活可逆性是是否全或无否是是酶调节否是（蛋白质激酶和磷蛋白磷酸酶）是（蛋白酶）同工酶：是指催化相同的反应但性质不同（Vjx和/或环不同）的酶。它们可能以不同的量出现在一种动物不同的组织或器官，也可能出现在任何真核生物细胞不同的细胞器。别构调节：其原理在于一些酶除了活性中心以外，还含有所谓的别构中心,该中心能够结合一些特殊的配体分子（有时为底物）。当别构中心结合配体以后，酶构象发生改变，从而影响到活性中心与底物的亲和力，并最终导致酶活性发生变化。能够进行别构调节的酶称为别构酶，与别构中心结合调节酶活性的配体分子称为别构效应物。起抑制作用的别构效应物称为别构抑制剂，起

27、激活作用的别构效应物称为别构激活剂。由底物作为别构效应物产生的别构效应称为同促效应，否则，就称为异促效应。许多别构酶具有多个别构中心，能够与不同的别构效应物结合。具有协同效应的酶和无协同效应的酶都可以受到别构调节。别构调节最多出现在代谢途径中的反馈抑制，它是指一条代谢途径（通常是合成代谢途径）的终产物作为别构抑制剂抑制代谢途径前面限速酶的活性，因此也被称为终产物抑制。别构调节具有正协同效应的酶别构调节无协同效应的酶+别构激活剂+别构抑制剂S典型的别构酶具有的性质及Hill方程特征一种典型的别构酶具有以下性质：速度/底物浓度曲线为S型S形曲线显示了底物与酶结合的正协同性。在底物浓度很低的时候，只

28、有少数酶活性中心与底物结合，这时底物与酶的亲和性很低，即使提高底物浓度，也只能导致反应速度很小的增加。然而，随着更多的底物与酶结合，正协同效应开始起作用，致使酶与底物的亲和性大增,反应速度随之猛升。当底物浓度提高到一定水平的时候，别构酶就像双曲线酶一样被底物饱和，速度接近Vmax。具有别构效应物别构酶除了含有活性中心以外，还有别构中心。别构中心是底物以外的分子结合的位点，这些分子被统称为别构效应物。其中起激活酶活性的物质被称为别构激活剂相反起抑制作用的被称为别构抑制剂。o15对竞争性抑制的作用表现双相反应温和变性可导致别构效应的丧失通常是寡聚酶SS型作图和Hill方程既然米氏方程给出的是双曲线

29、（v对S作图），所以它不适合具有底物协同性的呈S型曲线的别构酶，但另一个与它关系密切的Hill方程却能够很好地说明别构酶的动力学，Hill方程是：Hill方程与米氏方程实际上十分相似，它们的主要差别首先是Hill方程中的底物浓度S被提高到h数量级，h被称为Hill系数；其次，方程底部的常数不是岛，而是Ko.5,该常数也被提高了h数量级。Ko.5与Km十分相似，因为它也是指速度为最大速度一半时候的底物浓度，但是，因为它不是米氏方程中的一部分，所以不能与岛混为一谈。Hill常数能够反映底物协同性的程度：如果h=l,这时的Hill方程实际上与米氏方程一模一样,这意味着酶不是别构酶,无底物协同性,速度

30、对底物作图应该为双曲线，Ko5=Km；如果hl,则速度对底物浓度作图呈S型曲线，酶具有正底物协同性；如果h1,则意味着酶具负底物协同性。V酶的共价修饰调节方式酶的共价修饰调节:是指酶活性因其分子内的某些氨基酸残基发生共价修饰而发生变化的过程。这种调节方式比别构调节要慢。共价修饰的方式有：磷酸化、腺昔酸化、尿昔酸化、ADP-核糖基化和甲基化，其中磷酸化是最为常见的形式。水解激活：大多数蛋白酶以无活性的酶原形式被合成，需要通过水解（由其它蛋白酶催化或自我催化）去除一些氨基酸序列以后才会有活性，这种调节酶活性的方式被称为水解激活。与共价修饰一样，水解激活是也一种全或无的调节方式，酶原状态没有活性，但

31、与共价修饰不同的是，它是不可逆的，即一旦被激活就不可能回到原来的非活性的酶原状态。调节蛋白及分类某些蛋白质能够作为配体与特定的酶结合而调节被结合酶的活性,这些调节酶活性的蛋白质称为调节蛋白，其中，激活酶活性的调节蛋白称为激活蛋白，抑制酶活性的蛋白称为抑制蛋白。抑制蛋白通常结合在酶的活性中心阻止底物与活性中心结合而达到抑制的效果。酶浓度的调节方式酶数量可以在DNA转录和RNA翻译两种水平上控制。乳糖操纵子的诱导原理，实践中，启动乳糖启动子表达为什么选用IPTG作诱导物？1、组成型表达：在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素的影响较少、或变化很

32、小。且基因表达产物通常是对生命过程必需的、必不可少的，这类基因通常被称为持家基因(housekeepinggene)。2、诱导(induction)：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。3、阻遏(repression)：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。4、协调表达：在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，使

33、各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。这种现象称为协调表达(coordinateexpression),这种调节称为协调调节(coordinateregulation)能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物(gratuitousinducer)o由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。某些诱导物与自然的B-半乳糖昔相似，且不能被酶分解，比如异丙基-B-D-硫代半乳糖昔，(isopropylthiogalactoside,IPTG)不被细菌分解性质稳定，它的浓度在实验中不会改变。复杂的动力学问题，便于研究。IPTG

34、能在缺乏lacY(乳糖通透酶)基因下而有效地被运送。半乳糖昔键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖昔和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为B-半乳糖昔酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。从基因水平解释大肠杆菌培养过程中葡萄糖和乳糖共同存在时的二次生长现象。当葡萄糖与乳糖共同存在时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，此时虽然阻遏蛋白解聚，但是由于葡萄糖的降解物抑制了cAMP的活性，并活化磷酸二脂酶，降低cAMP的浓度，使得结合在基因上的cAMP与CAP复合物减少，从而抑制转录过程。当葡萄糖用尽时，因为cAMP的量并没有立即提高很多，因此结构基因的转录仍处于关闭状态，细菌生

35、长缓慢。cAMP的量积累到一定程度时，乳糖分子与阻遏蛋白结合，此时cAMP与CAP复合物也结合到相对应的位点上，促进了结构基因的转录。综上所述，当大肠杆菌培养过程中存在葡萄糖和乳糖时会出现二次生长现象。+葡萄糖DNA+乳糖+葡萄SONAT-乳糖翻DNACAP结合位点启动序列操纵序列结构基因关闭关闭关闭开放转录mRNACZZ阻遏蛋白CAP色氨酸操纵子的调节机制及在代谢工程中的应用？调控作用主要有三种方式:阻遏作用、弱化作用、终产物Tip对合成酶的反馈抑制作用。弱化子：在tipmRNA5端trpE基因的起始密码前有一个长162t)p的mRNA片段被称为前导区，其中123150位碱基序列如果缺失，t

36、rp基因表达可提高6-10倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样。当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核昔酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123150区序列缺失会提高trp基因表达的原因。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。前导肽：第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。这些密码子参与了trp的转录弱化机制。trp操纵子转录的调控是通过Trp阻遏物实现的，它结合于操纵基因序列，但Trp阻遏物的DNA

37、结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合Trp阻遏物，并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）。在有高浓度色氨酸存在时，Trp阻遏物-色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于trp操纵基因序列，因此可以阻止转录。然而当色氨酸水平低时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。Trp操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（attenuation）的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控形式。细胞内Trp-tRNATrp浓度决定核糖体是否停留在trpmRNA中的前导序列内的两个连续的

38、色氨酸密码子处。当色氨酸水平高和Trp-tRNATrp可利用时，起转录终止作用的发卡环结构（由区3和区4之间）形成，RNA聚合酶刚好在一个聚尿嘻噪的下游处脫离DNA模板，转录终止。细胞内色氨酸有限，Trp-tRNATrp水平低时，核糖体就停留在RNA中连续的一对色氨酸密码子处。核糖体这一瞬间的停留给出时间使得一种替换的发卡结构在新的RNA中（由区2和区3之间）形成，是一种抗终止的RNA结构，它破坏了转录终止信号，使得RNA聚合酶能够继续沿着DNA模板滑动完成转录。奇色氨啟时喊基数：trp掾纵子60162-1593*135011968044011111T1PolL|1EDCBA1间隔区间隔医a弱

39、化子）结构基因调节作用J40樣昔酸|RNA11AUG约？kbmRNA厂图*-10丈Ift抒蔣trp躁纵予第四备途径操作实例-代谢工程实践代谢途径操作的应用1、微生物生产的产品得率和生产能力得率：主要影响生产成本，并受代谢通量向有助于目标产物生成的方向改向所影响。生产能力：是生物加工设备基本投资费用的关键性决定因素，可通过代谢通量的扩增而改进。生产能力依赖于底物吸收的比速率，0.2-0.5g底物/（g生物基质小时）得率和生产能力在大规模和低成本工业生产中更重要。用途经工程改造酒精生产菌株使其具有共代谢葡萄糖和木糖的能力和利用发酵工程技术优化生产工艺使重组菌株木糖代谢能力得到最大限度的发挥是转化木质纤维素类生物质资源酒精生产产业化的重要基础措施。2、扩大生物体可代谢的底物范围3、产生新的和独创的产品4、细胞性能的总体改进5、异生物的降解反馈阻遏与反馈抑制比较代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过量积累初级代谢产物；人为解除正常代谢调节，而大量积累初级代谢产物的发酵方式。代谢控制发酵方法：发酵条件控制、菌种遗传改造分解代谢降解物阻遏：几种底物同时存在时，易利用对难利用或利用快对利用慢底物分解的抑制作用。解除分解代谢降解