中医气虚开题报告

1、PAGE PAGE 16浙江中医学院攻读硕士研究生学位论文课题开题报告 书课题编号 课题全称 负责单位 研究生姓名导师姓名 职称 课题起止时间 申请开题时间 填 写 说 明本表由负责课题的研究生和导师与协作单位共同协商汇总填写。要求字迹清楚，简明扼要，说明问题。二、封面“起止时间”指本课题从开始到预计完成的总时间。三、第二项：应从发展传统医药学的科学、技术、经济、社会价值四方面说明课题的目的意义，并对古今、国内外情况分别作一扼要综述。第三项：应反映出本课题总的设想和构思、临床或实验设计主要方法和步骤以及资料处理和统计学方法。第四项：新课题填写预初试验情况；结转课题填写原课题截止转入新课题，到目

2、前为止已完成的主要工作情况。第五项：指本课题按学年应完成的进度、指标计划、要求内容、时限、明确具体、切实可靠。第七项：经费预算除低值消耗品外，均应具体分项祥列。新课题除填写申请经费总额外，需注明本年度费用数。结转课题只填本年度申请经费数。第八项：新课题应附同行评议记分表。开题报告及其他新课题除、项外，均应逐项填写。结转课题一般只填、项即可（其他项有变化时可补填）。11、12项可分阶段记载有关事项。1.参加课题的研究生导师及指导小组成员的姓名、职称、专（兼）职：姓名职称专（兼）职 工作单位（部门）. 课题负责人（研究生导师签章） 年 月 日 2.目的意义与国内外进展情况实验目的意义：对心气虚动物

3、模型的造模方法及指标检测进行质量控制，以保证心气虚动物模型能较好反映心气虚证临床特征和病理改变，保证建立模型的规范性和可重复性，为心气虚证的临床研究和中药新药研究提供理想的模型。国内外研究进展情况：1在临床研究方面，对于心气虚证的研究已有了较多的工作基础。任树生等认为心功能障碍、心搏量减少、组织绝对或相对灌注不足，是产生心气虚证的病理基础1。廖家桢等观察了心气虚与心功能的关系，指出心功能检查对心气虚的辨证具有一定的定位、定性、定量的意义2。李绍芝等指出心输出量的减少是冠心病心气虚证发病机理之一3。贾宝善等认为心气虚证候的变化与左心功能不全密切相关，心气虚轻证组首先表现为舒张功能减退（PFI降低

4、，TPFR延长），重证心气虚患者除有心室舒张功能减退表现外，还有泵血功能减退（EF降低）4。王硕仁等进一步得出结论，左室舒张功能评价对心气虚诊断有高敏感性（87%），左室收缩功能则有高特异性（88%）5。此外很多研究表明了心气虚证在心钠素、环核苷酸、超氧化物歧化酶、血清过氧化脂质、血清丙二醛等指标上的变化6-10。在临床工作的基础上建立较规范的符合临床特征的心气虚证动物模型有利于对心气虚证进行更深层次的系统的研究。2在心气虚证动物模型的研制方面，1987年孙福立建立睡眠剥夺法心虚证模型，造成了类似心阴虚、心气虚或气阴两虚偏气虚证的大鼠心虚模型11；1989年金雁建立高胆固醇性免疫损伤加慢性放血

5、心虚证模型，且认为模型有气虚血淤的表现12；1995年程伟建立急性心肌缺血法心气虚证模型13；祖国医学认为心气虚证多由久病体虚、暴病伤正，禀赋不足或年高脏气虚衰等因素引起，我们认为上述各造模方法由于所造模型或偏于气阴两虚或与中医病因学相去甚远，所造模型与心气虚证的临床特征出入也较大，故不甚可取。1998年李绍芝14等用连续控食、强迫负重游泳（负重体重的55，10分钟/日），以及大剂量连续4天灌服心得安溶液致心气损耗等综合方法对NIH小白鼠进行了心气虚证造模，从造模因素而言，较符合中医传统病因，所造模型也表现出了与部分临床特征的吻合，至此，心气虚证动物模型已具雏形。我们曾用高脂饮食、免役定向损伤

6、、多次少量放血，多因素造模方法对家兔进行了心气虚证造模，所造模型夹杂了致血虚的因素15。3讨论中医证候动物模型的建立需要以其临床特征、特点为出发点，采用的造模因素、方法应当符合传统中医病因学而且可使动物表现出符合该证候临床的特征，这样才能保证所造模型与病证的证本质有较好的吻合；同时造模的方法应该力求规范，建立一套规范化程序，保证模型的可重复性，如此中医证候模型才能真正为临床研究和中药新药研究等服务，所以有必要对造模的因素、方法等进行分析论证，尽量排除主观因素的干扰。同时，对于心气虚证动物模型的评价指标选择及测定，由于其对象和方法的特殊性，需要我们在试验中对其进行有效的实验质量控制，以保证指标的

7、客观有效。在上述的各种造模途径中，存在着如下问题：造模因素选择与中医病因学出入较多，未对所选造模因素进行分析论证，难以确定其对动物体所起的作用如何；缺乏对动物种类、动物品系的筛选；未建立规范化的操作程序，缺乏对操作（造模、指标测定）的质量控制；这些问题使得造模带有一定的主观因素，难以保证模型能较好反映临床证候特征，也不能完全保证模型的可重复性。对上述问题，我们通过预试验和比较分析发现，心气虚证造模的因素以疲劳为主较为合理；动物的选择上则以wistar大鼠为宜，无论是疲劳运动还是心功能测定（左心室内直接测取血流动力学指标）都较为易控；疲劳运动方式采用力竭运动较为合适。3主要研究内容、临床设计或实

8、验设计、主要技术路线、预期结果主要研究内容：对心气虚动物造模中所用的造模因素、造模方法、指标检测方法进行论证、验证和标准化控制，以形成心气虚动物模型的规范化造模方法和指标检测方法。实验设计：应用比较医学的方法，采用3个品系大鼠和4个品系小鼠进行心气虚造模后，筛选出较合理的造模方法和动物品系。通过各种检测指标间的比较，建立心气虚证动物模型的品价标准。试验方法如下：实验动物清洁级1822g小鼠封闭群NIH和近交系BALB/c 、C57BJ/6J和DBA/2清洁级180220g大鼠封闭群Wistar和SD、近交系WKY实验分组大、小鼠每种方法每种品系各90只，分为3组：正常组30只、模型组60只，造

9、模结束后，正常组和模型组各取20只进行指标测定，其余的模型组分为20只补心气药物反证组和20只补心阴药物反证组造模方法1.大鼠心气虚证强迫游泳模型组：大鼠60只，雌雄各半。实验全过程连续按基础进食量进食（每只大鼠每日喂大鼠精饲料4g/100g）。每天强迫负重（按大鼠自身重量5%计）游泳至头没入水下10秒钟为耐力极限。实验16天后，第17天起每日灌服心得安溶液2.4mg/100g体重，连续4天。造模结束后，于实验第21天取大鼠20只进行指标测定（10只测定生化指标，10只测定血流动力学）。然后将余下的大鼠分为20只补心气药物反证组和20只补心阴药物反证组，分别灌服补心气口服液和滋心阴口服液（咸宁

10、制药厂 国家中医药管理局认可）0.5ml/100g体重（含生药1g/ml），连续7天。测定相关指标（10只测生化指标，10只测血流动力学）。心气虚证强迫跑步模型组：大鼠60只，雌雄各半。实验全过程连续按基础进食量进食（每只大鼠每日喂大鼠精饲料4g/100g）。每天以35米/分钟的速度强迫跑步，以受电击30秒后仍不能跑为疲劳标准。实验16天后，第17天起每日灌服心得安溶液2.4mg/100g体重，连续4天。于实验第21天取大鼠20只进行指标测定（10只测定生化指标，10只测定血流动力学）。然后将余下的大鼠分为20只补心气药物反证组和20只补心阴药物反证组，分别灌服补心气口服液和滋心阴口服液（咸宁

11、制药厂 国家中医药管理局认可）0.5ml/100g体重（含生药1g/ml），连续7天。测定相关指标（10只测生化指标，10只测血流动力学）。健康对照组：大鼠60只，实验全过程自由进食，食量不限。第17天起每日灌服生理盐水0.5ml/100g体重，连续4天。实验第21天，取大鼠20只进行指标测定（10只测定生化指标，10只测定血流动力学），然后将余下的大鼠再作为药物反证组的对照组，每天灌胃生理盐水，实验结束后测定相关指标。2.小鼠方法同上症状体征观察观察动物的心率、呼吸、脉搏、舌象、皮毛、体重、耐力。指标测定用MedLab测定血流动力学的各项指标。操作方法：用3%戊巴比妥钠按30mg/kg体重腹

12、腔注射麻醉后，固定，剪去术野的毛，从颈部正中线切开皮肤，分离出气管，在无血管处剪一“V”形切口，插入气管插管，用线固定。沿胸锁乳突肌内缘将筋膜分开，分离出右侧颈总动脉，结扎远心端，用动脉夹夹住近心端，并在颈总动脉剪一“V”形切口，插入含0.1%肝素生理盐水的细塑料管直至左心室，并联结TP-100T型压力换能器接于MedLab生物信息采集处理系统，记录左室血流动力学的各项指标。用放射免疫法测定血浆ANP、血浆cGMP、cAMP用分光光度法测定血清的sIgA、IgG和MDA、SOD等指标试验质量控制（一）造模方法的质量控制1.力竭运动力竭运动采取游泳和跑步两种方式以比较二者的在造模中的作用，选出较

13、适合心气虚证造模的力竭方式。运动力竭判断标准参考Tomas报道的文献。正式实验前应对动物进行运动方式的筛选，并适应性训练23天。游泳组于直径25cm、水深50cm、水温30摄氏度的玻璃圆缸中缚以体重5%的负荷（经预实验确定此负荷）单独游致力竭(以鼻孔被淹没10s，无力上浮为标准 )，动物造模期间，为避免寒凉伤及阳气而致阳虚，水温应控制在30摄氏度，为防止动物游泳后感冒，除室温应保持在2530度之间，游泳后应擦干动物的皮毛;跑台组在电动跑台上以30m/min的速度(经预实验确定此最大速度)，100的坡度跑步致力竭(以落在电极附近10s，驱赶无效为标准)。均以秒表计时。力竭运动时间为每日一次，游泳

14、共1416天，跑步约为20天。据我们观察，SD大鼠和Wistar大鼠运动至此时限即表现出外观形态、活动状态等系列的虚证表现。动物跑步力竭运动较为特殊，需注意以下：动物筛选 大鼠对跑步这种运动方式适应性差异性较大，少数大鼠即使接受各种刺激仍然拒绝跑步，呈现出无助状，这类大鼠无法达到试验目的，应从试验跑步组中剔除。跑步速度 目前，多数学者对机体损伤程度与运动负荷的关系基本持相同观点，认为较大负荷运动对心血管系统功能影响不利，长期超负荷训练可使机体内自由基产生增加 ,因而可能会降低机体的抗氧化能力。所以在造模过程中的跑步速度应在动物可承受的前提下，宜大不宜小，这样对心气虚证的造模是有积极意义的。据此

15、，通过预试验的观察，我们认为大鼠跑步的最大速度宜为30m/s 。当速度大于此值时，其脚爪很容易受伤，一方面影响造模的进程，另一方面，对模型施加了不必要的干扰因素。C. 刺激方式 跑步过程中大鼠速度变慢落在跑道后端时，对其施以可逃避的电击（300v 0.4mA），刺激其继续运动至力竭。电刺激可对大鼠产生长期的慢性应激反应，该应激可引起大鼠血浆内皮素与一氧化氮浓度同时升高及显著提高大鼠血儿茶酚胺和皮质酮水平，这些应激反应对运动大鼠的心功能而言，无疑是雪上加霜。2.控食心气虚动物造模的大鼠饮食控制应做到：大鼠饲料符合国家标准实验动物 全价营养饲料GB14924-94的要求。成年大鼠24小时的饲料量为

16、体重的5单笼饲养饮水不限3.bata受体阻断剂（心得安）在心气虚造模中通过灌服给药，在动物疲劳运动致虚证可见时应用心得安。每只小鼠灌服心得安的剂量是每日0.5mg，每只成年大鼠应给剂量为每日53mg/kg。每日一次，连续4天。4.试验进程控制动物的运动耐力、体重可以从一定程度上反映动物的气虚症状。以力竭运动时间观察动物的运动耐力；普通电子天平称取动物体重；实验过程中每日记录动物的疲劳运动时间、体重，取每组均值作出曲线图表，当二者均为下降趋势，且实验动物表现出精神不振、活动减少、鼠尾淡白、弓肩缩背、行迟缓动等外在体征时，给予大剂量心得安灌服。（二）评价指标的选择及质量控制1.血流动力学指标的测定

17、：测定大鼠在体心脏的左室内压 ,一般采用经动脉插管法和开胸后自尖穿刺法，这两种方法所测得的数据往往有较大差异。在试验中，我们使用了Medleb生物信号记录分析系统，采用颈总动脉插管和经动脉直接测定左室内压的方法。主要设备：Medlab生物信号采集分析系统、压力换能器、聚乙烯p50导管方法：运行Medlab，调整至同时测量心内压及动脉压的配置，并用水银血压计校准系统参数，保存配置。大鼠腹腔给3戊巴比妥钠0.1ml/kg 。麻醉后，结扎右侧颈动脉近头端，近心端用动脉夹夹牢，导管（导管内充盈肝素溶液 mg/ml，实验前肝素溶液浸泡）从在被结扎的动脉段上剪开的v形口插入后，用无齿镊夹住1导管、血管结合

18、部位，松开动脉夹，迅速向心脏推进导管，同时观察Medlab显示的波形变化，进入左室时可见较大的规则室内压波形出现，同时出现压力负值，v形口处结扎固定。插心导管的同时应进行股动脉压的测量。室内压波形和动脉压波形同时出现后，观察10分钟，波形稳定时进行采样。实际操作中，为了保证所得数据的客观准确，需要注意如下事项：Medlab采样应使用同一配置导管、压力换能器应与大鼠心脏处在同一水平面导管中应无气泡，充盈肝素推进导管过程中，如遇到阻力，不可用力再进，可调整角度后进入，动作宜轻柔，以免损伤血管和心室内壁导管插入过程不宜超过10分钟采样后取数据时，应取满一个呼吸周期麻醉药物注射剂量须准确2.SOD、M

19、DA的检测采用黄嘌呤氧化酶法测定造模动物血清SOD活性，MDA采用硫代巴比妥酸比色法测定，试剂盒均由南京建成生物工程研究所一分所提供。3.cAMP、cGMP的检测放射免疫法测定血浆cGMP、cAMP；cAMP，cGMP试剂盒（A BECKMAN COULTER COMPANY，FRANCE）4.心钠素的检测放射免疫法测定血浆ANP；血浆心钠素放射免疫试剂盒（中国原子能科学研究院）5.肌钙蛋白的检测改良双抗体夹心ELISA法。CtnI（肌钙蛋白I）试剂盒（江苏省人民医院心血管病研究所）七、规范化研究：根据比较研究和筛选的结果进行重复实验，验证其重复性、再演性，通过反复比较研究进一步完善复制模型所

20、用的方法、动物品系、级别、试剂、仪器、诊断和测定的指标，以及量化的程度，确立复制心气虚证动物模型的规范化方法和评价的标准。八、统计学方法：数据处理和分析采用新药统计程序5.0版，1996.6测定大鼠在体心脏的左室内压 ,一般采用经动脉插管法和开胸后自尖穿刺法，这两种方法所测得的数据往往有较大差异。在试验中，我们使用了Medleb生物信号记录分析系统，采用颈总动脉插管和经动脉直接测定左室内压的方法。主要设备：Medlab生物信号采集分析系统、压力换能器、聚乙烯p50导管方法：运行Medlab，调整至同时测量心内压及动脉压的配置，并用水银血压计校准系统参数，保存配置。大鼠腹腔给3戊巴比妥钠0.1m

21、l/kg 。麻醉后，结扎右侧颈动脉近头端，近心端用动脉夹夹牢，导管（导管内充盈肝素溶液 mg/ml，实验前肝素溶液浸泡）从在被结扎的动脉段上剪开的v形口插入后，用无齿镊夹住1导管、血管结合部位，松开动脉夹，迅速向心脏推进导管，同时观察Medlab显示的波形变化，进入左室时可见较大的规则室内压波形出现，同时出现压力负值，v形口处结扎固定。插心导管的同时应进行股动脉压的测量。室内压波形和动脉压波形同时出现后，观察10分钟，波形稳定时进行采样。实际操作中，为了保证所得数据的客观准确，需要注意如下事项：Medlab采样应使用同一配置导管、压力换能器应与大鼠心脏处在同一水平面导管中应无气泡，充盈肝素推进

22、导管过程中，如遇到阻力，不可用力再进，可调整角度后进入，动作宜轻柔，以免损伤血管和心室内壁导管插入过程不宜超过10分钟采样后取数据时，应取满一个呼吸周期麻醉药物注射剂量须准确2.SOD、MDA的检测采用黄嘌呤氧化酶法测定造模动物血清SOD活性，MDA采用硫代巴比妥酸比色法测定，试剂盒均由南京建成生物工程研究所一分所提供。3.cAMP、cGMP的检测放射免疫法测定血浆cGMP、cAMP；cAMP，cGMP试剂盒（A BECKMAN COULTER COMPANY，FRANCE）4.心钠素的检测放射免疫法测定血浆ANP；血浆心钠素放射免疫试剂盒（中国原子能科学研究院）5.肌钙蛋白的检测改良双抗体夹

23、心ELISA法。CtnI（肌钙蛋白I）试剂盒（江苏省人民医院心血管病研究所）七、规范化研究：根据比较研究和筛选的结果进行重复实验，验证其重复性、再演性，通过反复比较研究进一步完善复制模型所用的方法、动物品系、级别、试剂、仪器、诊断和测定的指标，以及量化的程度，确立复制心气虚证动物模型的规范化方法和评价的标准。八、统计学方法：数据处理和分析采用新药统计程序5.0版，1996.6主要技术路线 模型组正常组 模型测试组正常测试组 重复验证 重复验证药物反证组自然恢复组正常对照组 测定NK、ANP、cAMP、cGMP、IgA、IgG、IgM、MDA、SODNKANPcAMP测定LVP、dp/dt、dp

24、/dt、BP、HR症状、体征观察 比较分析 筛选 规范化 确立规范化的造模方法和评价标准 预期结果圆满完成实验，筛选出建立心气虚证动物模型的规范化方法，找出敏感性高的动物品系，找出与心气虚证敏感性和特异性强的相关的指标以及评价指标的量化程度，建立心气虚证动物模型的规范化评价标准提交论文心气虚证动物模型的评价指标、用比较的方法建立心气虚动物模型、心气虚证动物模型造模的质量控制国内相关杂志发表相关研究成果。4.目前进展情况（预初实验情况）1.完成心气虚证动物模型及评价指标的相关综述，并解决了模型复制过程中的技术难题及相关指标问题，初步筛选了评价指标。2.已完成本课题的预实验及正式实验中大鼠三个品系

25、的模型建立，检测了相关指标。初步筛选了比较可靠的造模方法及敏感指标。5.按学年分阶段具体进展指标 5.按学年分阶段具体进展进度安排：2001. 7 2001. 9 文献资料的检索、学习、撰写综述2001. 10 2001.11 预实验及撰写开题报告2001.12 2002. 6 实验研究2002. 72002. 8 数据统计、撰写论文6现有主要仪器、设备1、Medlab生理记录仪2、高速冷冻离心机3、紫外可见分光光度计4、跑步机5、游泳缸 7.经费预算、总计（金额）试剂费、实验费、资料费包括以下（单位：元）购买动物费 20000动物饲养费 60000试剂盒 20000病理切片、分析 2000资料检索复印打印查新费 500开题、论文答辩费 2000 共计： 104500 元8.课题承担单位意见（系、部、医院、所意见）（签章） 年 月 日 9.同行评议意见（开题报告委员会意见）（签章） 年 月 日10.科研处意见（签章） 年 月 日11.课题进展情况 已完成准备阶段的各项工作，预试验已结束，大鼠模型比较成功。经MEDLAB生理信号