脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

1、脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期：2012-06-25 来源：互联网 作者：青岚 点击：3644次摘要：细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 HYPERLINK /extend/redirect-htm-aid-24.html o t _blank 找产品，上生物帮 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理

2、想的 HYPERLINK /zhuanti/product/201307/440205.html t _blank 细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-1-2，3-Dioleyoxy， Propyl-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1：1(w/w)。它适用于把 HYPERLINK /zhuanti/product/20

3、1308/442416.html t _blank DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个 HYPERLINK /zhuanti/product/201307/440341.html t _blank DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从15g和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，

4、确定出转染时间(224小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/444034.html t _blank 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。一、脂质体(liposome)转染方法原理脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体(Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的 HYPERLINK /zhuanti/product/

5、201308/443762.html t _blank 真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/444264.html t _blank 细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。二、 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/441868.html t _blank 脂质体转染操

6、作步骤1、操作步骤方法一：(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含12105个细胞培养液，37CO2培养至40%60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10g DNA，终量100L，B液：用不含血清培养基稀释2-50gLR，终量100L，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。(4)转

7、染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37温箱置624小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二：(1)以5105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到5060%板底面积。(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。室温下放置510分钟，使DNA结合在脂质体上。(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后

8、弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37培养35小时。(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养1424小时，(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养2448小时。(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆

9、筛选法进行。三、个人经验：本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。(别的方法可以参考生产商提供的protocol)1、转染前1天将0.52105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达9095%。2、准备复合物(1) 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。(2) 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室温孵育5分。注意：必须在25分内进行。(3) 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。3、吸去培养板

10、的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。4、将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。5、将细胞放入培养箱孵育46h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。6、2448h后可以观察转入基因表达情况。7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换筛选培养基筛选。8、优化：要保证细胞汇合率达9095%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.51：5，一般细胞1：23.脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是阳离子脂

11、质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件：脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。测量学模拟试卷单项选择题（每小题1 分，共20 分）在下列每小题的四个备选答案中选出一个正确的答案，并将其字母标号填入题干的括号内。得分评卷人复查人1经纬仪测量水平角时，正倒镜瞄准同一方向所读的水平方向值理论上应相差（A ）。A 180 B 0 C 90 D 2702. 1：5000地形图的比例尺精度是（ D ）。A 5 m B 0.1 mm C 5 cm D 50 cm 3. 以下不属于基本测量工作范畴的一项是（ C）。A 高差测量 B 距离测量 C 导线测量 D 角度测量4. 已知某直线的坐

12、标方位角为220，则其象限角为（D ）。A 220 B 40 C 南西50 D 南西405. 由一条线段的边长、方位角和一点坐标计算另一点坐标的计算称为（A ）。A 坐标正算 B 坐标反算 C 导线计算 D 水准计算6. 闭合导线在X轴上的坐标增量闭合差（ A ）。A为一不等于0的常数 B 与导线形状有关 C总为0 D 由路线中两点确定7. 在地形图中，表示测量控制点的符号属于（D ）。A 比例符号 B 半依比例符号 C 地貌符号 D 非比例符号8. 在未知点上设站对三个已知点进行测角交会的方法称为（A ）。A 后方交会 B 前方交会 C 侧方交会 D 无法确定9. 两井定向中不需要进行的一项

13、工作是（C ）。A 投点 B 地面连接 C 测量井筒中钢丝长度 D 井下连接10. 绝对高程是地面点到（ C ）的铅垂距离。A 坐标原点 B任意水准面 C 大地水准面 D 赤道面11下列关于等高线的叙述是错误的是：（A ）高程相等的点在同一等高线上等高线必定是闭合曲线，即使本幅图没闭合，则在相邻的图幅闭合等高线不能分叉、相交或合并等高线经过山脊与山脊线正交12下面关于非比例符号中定位点位置的叙述错误的是（B ）A几何图形符号，定位点在符号图形中心B符号图形中有一个点，则该点即为定位点C宽底符号，符号定位点在符号底部中心D底部为直角形符号，其符号定位点位于最右边顶点处13下面关于控制网的叙述错误

14、的是（D ）国家控制网从高级到低级布设国家控制网按精度可分为A、B、C、D、E五等国家控制网分为平面控制网和高程控制网直接为测图目的建立的控制网，称为图根控制网14下图为某地形图的一部分，各等高线高程如图所视，A点位于线段MN上，点A到点M和点N的图上水平距离为MA=3mm，NA=2mm，则A点高程为（A ）ANM37363536.4m 36.6m 37.4m 37.6m100301303010030DCBA15如图所示支导线，AB边的坐标方位角为，转折角如图，则CD边的坐标方位角为（ B ）A B C D16三角高程测量要求对向观测垂直角，计算往返高差，主要目的是（D ）有效地抵偿或消除球差

15、和气差的影响有效地抵偿或消除仪器高和觇标高测量误差的影响有效地抵偿或消除垂直角读数误差的影响D有效地抵偿或消除读盘分划误差的影响17下面测量读数的做法正确的是（ C ）用经纬仪测水平角，用横丝照准目标读数用水准仪测高差，用竖丝切准水准尺读数水准测量时，每次读数前都要使水准管气泡居中经纬仪测竖直角时，尽量照准目标的底部18水准测量时对一端水准尺进行测量的正确操作步骤是（ D ）。A 对中-整平-瞄准-读数 A 整平-瞄准-读数-精平C 粗平-精平-瞄准-读数 D粗平-瞄准-精平-读数19矿井平面联系测量的主要任务是（ D ）A 实现井上下平面坐标系统的统一 B 实现井上下高程的统一C 作为井下基

16、本平面控制 D 提高井下导线测量的精度20 井口水准基点一般位于（ A ）。A 地面工业广场井筒附近 B 井下井筒附近C 地面任意位置的水准点 D 井下任意位置的水准点填空题（每空2分，共20分）得分评卷人复查人21水准测量中，为了进行测站检核，在一个测站要测量两个高差值进行比较，通常采用的测量检核方法是双面尺法和 。22直线定向常用的标准方向有真子午线方向、_磁北方向_和坐标纵线方向。23地形图符号一般分为比例符号、_半依比例符号_和不依比例符号。24 井下巷道掘进过程中，为了保证巷道的方向和坡度，通常要进行中线和_的标定工作。25 测量误差按其对测量结果的影响性质，可分为系统误差和_偶然误

17、差_。26 地物注记的形式有文字注记、 _ 和符号注记三种。27 象限角的取值范围是： 0-90 。28 经纬仪安置通常包括整平和 对中 。29 为了便于计算和分析，对大地水准面采用一个规则的数学曲面进行表示，这个数学曲面称为 参考托球面 。30 光电测距仪按照测量时间的方式可以分为相位式测距仪和 差分 。名词解释（每小题5分，共20分）得分评卷人复查人31竖盘指标差竖盘分划误差32水准测量利用水准仪测定两点间的高差33系统误差由客观原因造成的具有统计规律性的误差34视准轴仪器望远镜物镜和目镜中心的连线简答题（每小题5分，共20分）得分评卷人复查人35简述测回法测量水平角时一个测站上的工作步骤

18、和角度计算方法。对中，整平，定向，测角。观测角度值减去定向角度值36什么叫比例尺精度？它在实际测量工作中有何意义？图上0.1毫米在实地的距离。可以影响地物取舍37简述用极坐标法在实地测设图纸上某点平面位置的要素计算和测设过程。38高斯投影具有哪些基本规律。计算题（每小题10分，共20分）得分评卷人复查人39在1：2000图幅坐标方格网上，量测出ab = 2.0cm, ac = 1.6cm, ad = 3.9cm, ae = 5.2cm。试计算AB长度DAB及其坐标方位角AB。abdceBA120014001600180040从图上量得点M的坐标XM=14.22m, YM=86.71m；点A的坐

19、标为XA=42.34m, YA=85.00m。试计算M、A两点的水平距离和坐标方位角。测量学 标准答案与评分说明一、 单项选择题（每题1分）1 A； 2 D； 3 C； 4 D； 5 A； 6 C； 7 D； 8 A； 9 C； 10 C；11 A；12 D；13 B；14 A； 15 B；16 A；17 C；18 D； 19 A；20 A二、 填空题 （每空2分，共20分）21 变更仪器高法22 磁北方向23 半依比例符号（或线状符号）24腰线25偶然误差26数字注记27 大于等于0度且小于等于90度（或0, 90）28 对中29 旋转椭球体面30 脉冲式测距仪三、 名词解释（每题5分，共2

20、0分）31竖盘指标差：在垂直角测量中，当竖盘指标水准管气泡居中时，指标并不恰好指向其正确位置90度或270度，而是与正确位置相差一个小角度x, x即为竖盘指标差。32 水准测量：利用一条水平视线并借助于水准尺，测量地面两点间的高差，进而由已知点的高程推算出未知点的高程的测量工作。33 系统误差：在相同的观测条件下，对某量进行了n次观测，如果误差出现的大小和符号均相同或按一定的规律变化，这种误差称为系统误差。34视准轴：望远镜物镜光心与十字丝中心（或交叉点）的连线。四、 简答题（每题5分，共20分）35（1）在测站点O上安置经纬仪，对中，整平（1分）（2）盘左瞄准A点，读数LA，顺时针旋转照准部到B点，读数LB，计算上半测回角度O1=LB-LA； （2分）（3）旋转望远镜和照准部，变为盘右方向，瞄准B点读数RB，逆时针旋转到A点，读数RA，计算下半测回角度O2=RB-RA； （3分）（4）比较O1和O2的差，若超过限差则不符合要求，需要重新测量，若小于限差，则取平均值为最终测量结果 O = （O1+O2）/2 （5分）36 图上0.1mm对应的实地距离叫做比例尺精度。（3分）其作用主要在于：一是根据地形图比例尺确定实地量测精度；二是根据地形图上需要表示地物地貌的详细程度，确定所选用地形图的比例尺。（5分）37 要素计算