发酵饲料生产工艺与应用

1、Word 文档发酵饲料生产工艺与应用灵璧县立腾同创农牧科技有限责任公司二 0 一二年H一月目录省立腾同创农牧科技简介省立腾同创农牧科技企业文化省立腾同创农牧科技的十年发展战略 省立腾同创农牧科技的第一个发展五年发展计划第一章发酵饲料生产的菌种及发酵工艺第二章发酵饲料生产技术第一章发酵饲料生产的菌种及发酵工艺第一节概述发酪饲料的定义发酪饲料的定义是：在人为可控制的条件下，以植物性农副产品为主要原料，通过微生物的代作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料原料。采用发酪技术生产的动物饲料或饲料原料，其特性主要

2、是：(1)含有大量的活性微生物；(2)多数以厌氧发酪方式进行生产；(3)未经干燥的物料含水量通常在 30%H上；(4)物料的酸性物质明显增加，营养组成更合理；(5)生产原料以植物性农副产品为主。也有发酪成品是经过干燥处理的，比较典型的有发酯豆粕和发酷棉粕。在发酪过程中有大量的活性乳酸菌和酯母菌发生的代作 用，经过干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它们也属于发酪 饲料。二、发酪饲料的概述发酯饲料的生产工艺基本都是以固态发酪的方式进行的，生产菌种以乳酸菌、芬胞杆菌和酯母菌为主，绝大多数采用厌氧或兼性 厌氧发酯。发酪物料的含水量为30%50%发酪时间和温度受环 境影响很大，基本不进行人为控制和调节。

3、在实际生产中也有采用好氧发酯方式进行的，生产菌种以霉菌和假丝酪母为主，生产用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酯母菌难 以降解的杂粕和胶质蛋白。但是生产设备复杂，物料温度和湿度 Word 文档Word 文档变化很大，控制及其困难。成品主要是作为饲料蛋白原料的替代 物，能降低饲料生产成本，但基本不具备生物学活性和功能。本节主要论述厌氧固态发酯工艺，常规的发酯饲料生产流程如： 原料一消毒-冷却接种-培养-干燥一包装工业化规模的微生物发酪过程基本上都是纯培养过程，原料需要消毒，空气需要过滤等。这些操作都是为了确保在发酪产品生产 和储存过程中不受杂菌的侵袭和干扰，但也正是这些常规操作使产品的生产成本居高不下

4、，影响了微生物发酯产品在动物饲养中 的大剂量使用。大量试验证明，在不考虑动物饲养成本的前提下，大剂量（在配 合饲料中添加5.0蛆上）使用高活菌含量的微生物发酯饲料可以 明显改善动物的生产性能， 提高动物的健康水平，甚至可以进行 无抗生素饲养。但是采用传统的生产工艺获得的高活菌产品其生 产成本通常都在10元/kg以上，如果以10%勺比例使用在配合饲 料中，每吨配合饲料的成本至少需要增加 800元，这个增加值对 传统的畜禽养殖业来说是难以接受的。降低发酯饲料生产成本最直接的方式就是简化生产工艺，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是 最耗能的操作过程，是导致生产成本增加的主要步骤， 也是导致 生产设备投资增

5、加的主要原因。 如能简化生产操作工艺步骤，同时又能保证产品质量的安全稳定，就能使发酪饲料的生产和应用 具备强大的市场竞争力。第二节 发醉饲料的生产菌种 发酯饲料的生产菌种很多，主要有：乳酸菌、芬抱杆菌、酯母菌 和霉菌。一、乳酸菌目前生产中使用的乳酸菌至少有 30多种。按乳酸菌的代途径， 大致可归纳为四种类型：同型乳酸发酯、专性异型乳酸发酯、兼 性乳酸发酯和双歧杆菌异型乳酸发酯o（一） 同型乳酸发酯C6H12。62CH3CH（OH）COOH一分子葡萄糖分解成两分子乳酸，整个过程不产气，发酯转化理想，产物最合适，效率最高。典型的生产菌种主要有：德氏乳 酸杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热乳杆菌、粪

6、肠球菌、乳 酸乳球菌。（二）专性异型乳酸发酯C6H12O6CH3CH（OH）COOH+CH 3COOH+CO 2 T一分子葡萄糖转化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外还释放一分子二氧化碳。相比同型乳酸发酯，这种发酯的转化效率要 低得多，而且还有产气损失。典型的生产菌种主要有：发酪乳杆菌、高加索酸奶杆菌、短乳杆菌、巴氏乳杆菌。（三） 兼性乳酸发酯兼性乳酸发酯能同时进行同型乳酸发酯和异型乳酸发酪，这两种代进行的程度和比例取决于菌种的性质和外界培养条件。典型的生产菌种有：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠糖杆菌、清酒乳 杆菌。（四）双歧杆菌异型乳酸发酯2c6H12。6 2CH3CH（OH）COOH+3CH 3C

7、OOH比较典型的生产用菌种是动物双歧杆菌。双歧杆菌的培 格要求很严格，对厌氧要求极高，目前还很难在实际生产中 应用。乳酸菌分布广、种类多，有杆状和球形两大类。有单个、成 对和链状排列的，基本上都是厌氧菌或微需氧菌。在饲料青 储、发酪开始时就繁殖，到饲料因密封缺氧后仍然能繁殖， 只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度却快一些。乳酸菌能分解饲料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高饲料 的营养价值和适口性，同时还能抑制大肠杆菌和沙门氏菌等 有害微生物的生长代，使饲料产品能长期保存。在饲料青储 和发酪的过程中，同型和异型乳酸发酯同时存在，产物除乳 酸外还有少量乙醇和CO2。二、芬抱菌目前在生产中应用的芬胞

8、菌有近十种，以杆菌为主，主要为以下三种：地衣芬抱杆菌、枯草芬抱杆菌和蜡样芬抱杆菌。芬抱杆菌 能耐受高温，在有氧和无氧条件下都能存活。在营养缺乏、干旱 等条件下形成芬抱，在条件适应时又可以重新萌发成营养体。利用芬胞杆菌发酯饲料的目的主要是为了消耗培养体系中残留的 氧气，为乳酸菌创造一个厌氧环境。另外，近年来研究还发现， 有些芬抱杆菌能产生杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的 细菌素（也称抗菌肽），这些抗菌肽有很强的针对性，只对某些类型的微生物细胞有破坏作用，对酯母菌和乳酸菌没有影响。三、酯母菌酯母菌是一类单细胞真菌，形态多种多样，主要有球形、卵形和 丝状形（如假丝酷母），以出芬的无性繁殖为主，最

9、适宜生长温 度为2535 C, pH偏酸性（4.06.0）。酯母菌基本上都是兼性 厌氧菌，在有氧的条件下迅速增殖， 在无氧的情况下进行酒精发 酪（EMP）。目前在生产中应用的有 20多种，主要为以下三种： 酿酒酪母、热带假丝酷母、产肮假丝酪母。啤酒酪母和面包酯母 是最常用的酿酒酪母。热带假丝酪母和产肮假丝酪母的生长速度 很快，在适宜的温度和营养条件下， 它们的世代倍增时间不超过 3h,特别适合处理食品加工业产生的废水。酯母菌的个体比乳酸菌大得多，直径通常为26 g,体积几乎是乳酸菌的1000倍左右。工业生产中常用的酯母菌主要有酿酒 酪母和假丝酪母，酿酒酪母是生产啤酒、白酒等含乙醇类发酯物 的重

10、要菌种；假丝酯母主要用于好氧发酯生产动物饲料或者废水 处理。四、霉菌目前在生产中应用的霉菌有近十种，主要为：米曲霉、黑曲霉、 白地霉。一般来说利用霉菌发酪，基本上都是有氧发酪，发酪过 程会产生大量的代热，生产过程中料曲的温度控制往往是生产成 败的关键。霉菌发酪目前采用浅盘发酪，料曲厚度不超过5cm ,如果采用厚层发隙，需采用强通风装置，生产能耗很大，从这一 点上说，霉菌发酯不适于生产饲料或者饲料原料。目前，实际生产中利用霉菌主要是利用它能合成纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶的特性，利用廉价的粗蛋白原料作为发酪底物， 生产高活性的蛋白饲料或者粗酶制剂。五、选用生产菌种的基本原则（一） 安全性（必须同

11、时符合以下两个要求）（1）菌体本身不产生有毒有害物质。（2）不会危害环境固有的生态平衡（主要针对某些基因工程菌）。（二）有效性（能满足一个要求即可）（1）菌种本身具有很好的生长代活力，能有效降解大分子好抗 营养因子，合成小肽和有机酸等小分子物质。（2）能保护和加强动物微生物区系的正平衡。这种功效主要是指能有效维护和提高有益微生物在动物消化道中的数量优势，其可通过两种方式达到： 一种方式是利用发酪饲 料的生产菌种本身就是从饲养的目标动物的消化道中分离出来的有益菌，通过饲喂高比例的发酯饲料直接提高有益微生物的数 量，形成数量优势；另一种方式是利用生产菌种或代产物可以选 择性地抑制或者杀灭有害微生物

12、，形成有益菌的数量优势。实现 第二种途径的方式可以多种多样，比较常用的有：耗尽氧气，降 低体系的氧化还原电位；降低环境的 pH值；代物中含有能选择 性杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的抗菌物质等。第三节发醉饲料生产菌种之间的相互关系目前人类可利用的这些发醉技术基本上都是纯培养技术，而实际上在自然界中很难找由单一微生物存在的生态环境。据已有的微生物研究报道， 地球上存在的微生物超过 100 万种，而人类所分离的纯种累计不超过10万种，做过比较系统研究的不超过1万种。根据目前已有的研究成果，大体 可以把微生物之间的关系分为以下几种：中性共生、同住、 互惠共生、共生、竞争、拮抗和寄生。一、中性共生

13、这是指两种或两种以上的微生物同时存在于同一个环境中，但是它们之间没有直接的生态关系，各自生活互不干扰。例如淡水中生长的衣藻和水生细菌。二、同住这是指两种微生物同处在一个栖所， 其中一个获益，另一个 不受影响。常见的现象是一种微生物产生一种代物供另一种微生 物作为营养物质，或者产生适合于另外一种微生物生长的环境。发酯饲料生产中比较常见的例子有以下几种：酯母菌能在高浓度的糖液（25癖右）中生长。当糖被酯母菌消耗以后，糖浓度的 降低就有利于不耐受高渗透压的微生物（如乳酸菌）的生长。能分泌淀粉酶的微生物（芬抱菌）水解淀粉产生寡糖和单糖，为 另外一些只能利用还原性单糖的微生物生长提供营养。还有一种比较特

14、殊的同住微生物， 好气性菌可消耗氧气，降低环 境的氧化还原电位，使之适合于厌氧微生物的生长。 这种同住关 系只能产生在开始阶段，在后期就不是同住关系了。 这种现象在 发酯饲料到生产过程中经常遇到，也是利用微生物组合发酯生产发酪饲料的重要理论基础。三、互惠共生这是两种微生物互惠互利的现象，比较典型的菌种是阿拉伯 糖乳杆菌和粪链球菌的组合。阿拉伯糖乳杆菌不能合成苯丙氨 酸，粪链球菌不能合成叶酸。阿拉伯糖乳杆菌不能在缺少苯丙氨 酸的培养基上生长，粪链球菌也不能在没有叶酸的培养基上生 长。但是把它们组合在一起， 却可以共同在没有苯丙氨酸也没有 叶酸的培养基上生长，因为它们能相互为对方提供必需的限制性

15、营养物质。这种现象在自然界中普遍存在， 发酯饲料的菌种组合 应该多考虑这种组合优势。四、共生共生是指两种微生物在同一个严酷环境中彼此相依为命。比较典型的例子是地衣，它是蓝细菌（或蓝藻）与真菌共同组成的 一个形态和生理单位。蓝藻或蓝细菌的细胞仅限于特定的层，地 衣的菌丝交织成菌丝组织， 形成一个稠密的外皮层。 皮层下为蓝 藻的细胞层，在下面为菌丝疏松交织的菌髓层。真菌可以从蓝藻获得碳水化合物，真菌菌丝所摄取的水和无机盐又可以提供给蓝 藻，因此地衣能耐干旱、潮湿和抗寒冷。这种现象在发酪饲料的 生产过程中很难遇到，少有实用的例子。五、竞争当两种微生物对某种环境因子有相同要求时，就会发生生存竞争。由于

16、微生物的世代时间比较短，代强度大，所以生存竞争 往往表现的很激烈。在一个生存环境，不同的时间会出现不同的优势种。 这种优 势微生物在某种环境下能最有效地适应当时的环境，而环境条件一旦改变，就可能被另一种微生物代替弁发育成新的优势种。目前工业化发酪生产之所以采用纯种培养，其主要原因就是消除其他微生物的竞争。目标代物合成能力强的微生物其生长速度往往 比较低，至少比同类的野生菌低。野生菌的代活动是很“经济的”。 如果从生长速度分析，它们的物质和能量的利用效率要远高于生 产菌种。但是，由于生产成本的限制，发酪饲料的生产往往不能 采用纯种培养，所以微生物之间的生存竞争不可避免。如何巧妙利用微生物之间的生

17、存竞争是研究微生物发酯饲料生产的一个非常重要的课题。 从理论上分析，通过控制调节微生物生存环境可以调整物料中微生物的种类和数量分布，从而达到利用微生物有益菌群种群优势发酪饲料的目的，但是到目前为止， 有关方面的成熟技术还是很少。六、拮抗一种微生物可以产生不利于另一种微生物生存的代物质，或者通过代活动改变生存环境， 而这种环境不利于其他周围微生物 的生长，这种现象就称为“拮抗”。如：青贮饲料接种的乳酸菌和 醋酸菌在发酪过程中，不断降低 pH值，结果绝大多数不耐酸的 微生物不能生存，甚至趋向死亡。酯母菌在无氧条件下将糖发酯 成酒精，当酒精浓度达到一定数值时，其他微生物就不能生存。研究发现拮抗还具有

18、明显选择性， 农业部饲料工业中心分离 获得的枯草芬抱杆菌 MA139能分泌杀灭大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抗菌肽（细菌素），但对自身、酪母菌和乳酸 菌的生长代基本没有影响，这种拮抗的选择性是发酯饲料研究所 希望的。七、寄生一种微生物生活在另一种微生物体或体外，依靠摄取寄生细 胞的营养进行生长繁殖， 弁使后者遭受损害甚至死亡， 这种现象 称之为寄生。这种现象在饲料发酪过程中可能存在， 目前在研究 中还没有遇到。微生物是发酯饲料的动力来源， 研究发酯饲料中微生物的相 互关系是获得高质量发酪饲料的必要前提，也是饲料发酯生产的 核心。第四节发酯饲料的生产工艺一、固态厌氧发酯高活性生物饲料相对于

19、好养发酯，厌氧发酯的能耗低，微生物代产生的热量 也要小得多，生产过程往往不需要翻拌散热。另外，发酪产品只 要密封得当，即使长期存放也不会腐败变质。目前比较典型的固态厌氧发酯生物饲料的成功例子主要有 两种：一种是适合养殖户自产自用的袋装发酪饲料；另一种是属于规模化流水线生产的袋装发酪饲料。它们接种的微生物基本一致，主要有酯母菌、乳酸菌和芬胞杆菌。适合养殖户自产自用的发酯袋是一种普通的密封包装袋， 物 料接种以后装袋，再将袋口用绳扎紧，物料的含水量为30%40% 开始时，酪母菌消耗袋残留的氧气进行增殖和呼吸代， 同时也为乳酸菌创造一个厌氧的生活环境。然后，酪母菌在无氧条件下进行糖酯解，产生酒精和

20、CO2,乳酸菌也同时增殖、代，产生有机 酸。随着袋气压的不断增加， 不断有CO2带着酒精和有机酸排出 袋外，管理饲料的饲养员可以根据排出的酸香味来判定物料发酪 的成熟度。有氧发酪阶段：C6H12O6+6O 2 6CO2+6H 2。无氧发酪阶段：C6H12。62CO2+2C2H5OH（乙醇）在夏季，发酷35d就有明显的酸香味。在冬季，时间需要延长。如果环境温度低于 12 C,发酪就有可能归于失败。酪母在低温 下长期代低迷，不产生CO2,使得外界的O2长时间与接种的乳 酸菌接触，会导致乳酸菌活力大减，甚至死亡。事实证明，如果环境温度适宜，时间控制得当，采用上述袋装式 土办法发酪，也可以获得质量很好

21、的微生物发酯饲料，活性乳酸菌的含量能达到 108cuf/g以上。将其在生羊配合饲料中添加 15%20%生羊采食量能明显提高，最多能提高10%Z上，而且增重速度和健康水平也有显著提高。这种工艺虽然简单，但是受限制的因素很多，质量标准也很难把握，实际推广有一定困难。为了使这种袋装发酯技术进入程序化、 工业化应用，发酪饲料的 质量能得到有效保证，必须完成以下几个前提：发酪过程不受环 境温度限制；产品质量不受存放时间限制， 或者保质期能达到三 个月以上；产品在储存和运输过程中不受外界空气干扰。农业部饲料工业中心的微生物发酪饲料课题组发明了呼吸膜可 移动式固态厌氧发酯饲料（也称袋装发酯饲料）生产技术。这

22、种发酪技术的具体工艺流程如图1-1原料接种以后直接进入包装袋中， 包装袋上附加一个可以调节气 压的硅胶膜。在发酪过程中，微生物会产生CO2等气体，使得袋的气压大于外界常压。当袋气压达到某一临界值时，气体通过硅 胶膜排到外界。但是外界的气体始终没有机会进入发酪体系，从而也就排除了外界杂菌的干扰。研制的特定微生物菌种组合能使乳酸菌迅速繁殖，占据数量优 势，原料不需要消毒就可以直接用于接种培养。这种工艺很简单，如果以日产 30t计算，设备投资不超过 40万 元，特别适合在我国广大农村推广使用。第三章发酵饲料生产技术第一节 发酯饲料用乳酸菌的分离筛选乳酸菌是一类最常见的益生菌，生物饲料的发酪生产一般都

23、 离不开乳酸菌。乳酸菌种类很多，市场上流行的产品也极多，至 少有20多种。大量实验证明，只有动物消化道国有的微生物才 能在消化道定植，外源微生物只能短时间存活在消化道，不可能长期融合到动物消化道的微生态系统中。筛选发酪饲料的生产菌 种，其主体应该来源于最终适用的动物消化道，而乳酸菌细菌是动物消化道起主要作用的微生物。一、样品的采集为了获得合适的生产用乳酸菌，样品的采集很重要。适合于实 际生产的乳酸菌必须来源于健康动物的消化道，最好是在发生 了瘟疫的养殖场而幸存的畜禽。发生瘟疫的养殖场，动物大比 例死亡，幸存的畜禽虽少，但是生命力很顽强，是极好的生产 菌种采集样本。以下以筛选符合生羊健康养殖需要

24、的生物饲料用乳酸菌为例，叙述样品的采集和乳酸菌的分离。在实验室中对生羊进行攻毒试 验，在饲料中不断加大大肠杆菌（实验用E.ColiK88这是一种常见的攻毒试验用大肠杆菌）的用量，以检验生羊的抵抗力。经过 57d的试验，生羊的健康水平越来越差。我们选择其中两头最 健康的生羊进行屠宰，在无菌环境中提取它的胃液、 小肠液和大 肠液，迅速保存在无菌生理盐水（NaCl的浓度为0.9%中。目标乳酸菌一般都是厌氧菌，为了确保乳酸菌的活力， 需要尽可能降低生理盐水的氧化还原电位。 最简便的方法是在溶液中加入 适量的半胱氨酸，半月氨酸有茄基（一 SH）,有很好的还原力， 可以消除溶液中残余的氧。二、乳酸菌的分离

25、纯化样品中的目标乳酸菌含量一般都不是很高，而且还污染了其他 杂菌。为了提高筛选成功的几率，在样品进行分离纯化以前， 可以对样品进行选择性增殖培养，以增加目标乳酸菌的含量。样品的增殖培养比较简单，把经过适当处理的样品接种到适于 目标乳酸菌生长的培养基中。比较常用的是牛奶增殖培养液， 在无抗生素牛奶中补充 6%8%勺蔗糖，高温消毒、冷却，然后 用氮气或者二氧化碳驱除溶液中残留的空气，再接入适量采集 的样品，在3032 c条件下厌氧培养1024h。如果样品中的 目标乳酸菌含量比较低，可以适当延长培养时间。样品经过预增殖培养以后，目标乳酸菌含量明显提高，可以进 入下一步分离纯化操作。乳酸菌分离培养基通

26、常采用MRS琼脂培养基，其营养组成与pH如下：蛋白陈：5.0g/L;牛肉浸膏：4.0g/L;酯母膏：2.0g/L; 葡萄糖：12.0g/L;玉米浆：10.0mL;司盘80: 1ml;磷酸氢二钾： 1.0g/L ;三水乙酸钠：3.0g/L ;柠檬酸三俊：1.0g/L ;硫酸镁： 0.1g/L;硫酸镒：0.03g/L;琼脂：18.0g/L。pH6.20.2。加热溶解上述各组分，配制成均匀的溶液，分装在厌氧滚管中（每个管中加56mL）。在115 c消毒杀菌30min。冷去口至50 c 左右后，在冰水中滚动滚管，使固体培养基均匀凝固在管壁上。 为了指示培养基的氧化还原电位，可以在培养基中加入极少量 的

27、刃天青（一种显色剂），浓度0.02姆足够了。在低电位时培 养基显蓝色，随氧化还原电位不断上升，培养基的颜色逐步由 蓝转为浅蓝、粉红、红色。如果培养基的颜色转成粉红就基本 不合格了。同增殖培养过程一样，在MRS分离培养基中加入适 量的半胱氨酸可以在一定时间维持环境的低电位。分离纯化培养基准备好以后，就可以进行目标乳酸菌的分离操 作了。在超净工作台上（或者其他无菌环境中），对经过增殖培养的样 品进行梯度稀释，稀释液还是用无菌的生理盐水，把稀释后的 样品接种到厌氧滚管中， 密封（滚管有密封盖）。在3032 c条 件下培养12d。为了提高筛选几率，可以同时做多个稀释梯度样品的培养。如 果两天以后不出现

28、理想的菌落，可以再延长培养时间。虽然乳酸菌的最适宜生长温度是3740 C ,但是在分离筛选过程中，培养温度应适当调低，以降低其生长速度，这样菌落之 间的差异可以更明晰，也更有利于挑选理想的菌种。经过上述分离操作，我们获得了 5株乳酸菌，它们分别是:.来源于羊胃的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri);.来源于十二指肠的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri ).来源于小肠的屎肠球菌 ( Enterococcus faecium );.来源于空肠的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus );.来源于结肠的发酹乳杆菌(Lactobacil

29、lus fermentium )。三、发酯力和耐酸稳定性分析为了后续生产应用的需要，我们对分离获得的乳酸菌进行发酯 力测定和耐酸稳定性试验。发隙力测定比较简单，主要测定其乳酸菌的产量，具体方法如下：接种分离获得的细菌纯种于试管培养液中，3032。恒温培养12h,然后再扩大接种到牛奶瓶中，3032c恒温培养6h,测定乳酸含量。在乳酸发酯的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在，通过去除发酯液中的葡萄糖和蛋白质， 弁加入适当浓度硫酸酸化， 钙离子 转化成难溶的硫酸钙沉淀，使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳 酸。乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在 565 nm处有特征吸

30、收的紫色物质。在一定浓度围，乳酸含量与 565 nm处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定 565 nm处的吸光度来测定乳酸的含量。实验室乳酸含量的测定一、原理稀乳酸在 浓硫酸作用下加热，可以变成乙醛。乙醛与羟基联苯作用可以生成红色的复合物，在565nm条件下比色测定，可以确定乳酸含量。二、试剂1.4.0喻酸铜溶液将4g无水硫酸铜溶解在水溶液中，定容至 100ml。.羟基联苯(C6H5 c6H4OH)溶液将1g羟基联苯溶解于100ml浓度为0.08mol/L的NaOH溶液中， 储存在褐色试剂瓶中。.乳酸标准液将280mg纯乳酸锂溶于水中，配成 250mL溶液，其乳酸浓度为 1mg/mL,存

31、放于4c冰箱中。在做标准曲线时将溶液稀释 10倍, 使乳酸含量为100闺/mL。在分别取1, 2, 3, 4, 5, 6mL稀释 液，稀释配制成1, 2, 3, 4, 5, 6闺/mL乳酸标准液。.浓硫酸溶液在比色管中分别加入1mL乳酸标准液和0.05mL硫酸铜溶液，然 后加入6mL浓硫酸，放置5min ,冷却至20 c以下。三、标准曲线的制备和乳酸含量的测定在上述比色管中加入 0.05mL羟基联苯溶液，混合均匀，在室温 下放置68h ,过夜。在565nm波长下进行比色测定，绘制标准曲线。(1)最大吸收波长的确定乳酸发酯液样品显色后，表明，最大吸收波长为565 nm图2-1最大吸收波长的确定(

32、2)最佳显色条件的选择结果表明，氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著，其余因素的作用不显著，最佳显色条件为 A2B3c2D1E1F3,即氢氧 化钙0.05g , 20麻酸铜0.8 ml,浓硫酸6 ml,对羟基联苯 0.125 ml,静置时间15 min,加热显色时间 5 min。(3)乳酸标准曲线的制备乳酸标准应用液浓度在1080由/ml围与吸光度值基本呈线性关系，当浓度大于等于 60闻/ml时吸光度值大于1,考虑到仪 器误差的因素，故制备标准曲线时浓度围取在15、20、25、30、35、40、45、50由/ml ,得到如图的乳酸标准曲线，求得标准 曲线回归方程为 A=0.0189C0.

33、0808(A为吸光度值，C为乳酸浓度，n=8）, r=0.9989,在1550/ml围呈良好线性关系0.40.23010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110乳液可林液浓度（微克/富升）（图2-2 :乳酸标准应用液浓度与吸光度值之间的关系）LngLnd,O.CSSSSO.SO.102030105060乳酸标准液浓度（微克/塞升）（图2-3 :乳酸标准曲线）本实验对发肝液进行预处理， 排除蛋白质和葡萄糖的干扰， 使测定结果更接近真实值；优化了显色条件，使测定时操作简便，精确度高，显色稳定，准确度高，适合于发酯液中乳酸含量的测定。耐酸稳定性分析主要是考虑乳酸菌在实际使用过

34、程中过动物胃酸的成活问题。生长育肥羊的胃酸 pH比较低，一般的微生物很难在其中存活，这种功能实际上也利于生羊的健康， 使它可以在卫生条件比较差的环境中生存。 但是这种特性不利于外源有益 微生物的存活，外源有益菌必须先通过胃液的考验才能达到其发挥作用的场所（肠道）。所以耐胃酸稳定性也是决定乳酸菌实际 使用效果的一个重要指标， 具体检验方法如下：取1.0mL活菌数 量已知的培养液，在无菌条件下，接种到生长羊、牛的胃液中，在37。恒温培养。同时做6个平行，每隔1h取样1次，分析乳 酸菌数量的变化。在生长羊胃液中，上述5株菌都体现了很好的稳定性， 具存活 率都在50减上（见表2-4）表3-4各种乳酸细

35、菌在生长羊胃液中的稳定性时间/h123456格氏乳杆菌存活率/%罗伊氏乳杆菌存活率/%屎肠球菌存活率/%嗜酸乳杆菌存活率/%发酵乳杆菌存活率/%88.282.691.488.481.371.486.562.176.391.288.684.294.692.891.495.811213666.957.246.871.264.855.676.871.364.288.586.384.6本组试验均是在羊消化道中分离获得的乳酸菌都是天然菌， 没有经过基因工程改造，属于安全菌株。遗传性能稳定，不会随着传代而发生 变异，安全无毒。可以大量应用在牛、羊等饲料中。另有研究提出在模拟的胃酸中（pH值与真实胃液胃酸相

36、同）进行稳定性试验，其结果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中的稳定性， 其原 因是真实胃液中蛋白酶对外来生物活性物质具有极强的分解作用，破坏了相当部分外来多酶蛋白和一些细菌素的活性。 这是自然界一种自 我保护的功能。第二节发醉饲料用芽泡杆菌的分离筛选和安全性评价 芽泡杆菌也是一类比较常见的发醉饲料生产菌，但是这类菌 的应用效果与菌种来源、饲养环境和动物类型都有很大的关 系。虽然种类很多，但是真正能体现由稳定的、优良效果的 还很少。另外，芽抱杆菌不同于乳酸菌和酿酒醉母（或者啤酒醉母），乳酸菌和解母菌的安全稳定性一般都很可靠（一些耗氧发醉 的丝状醉母除外），但是芽泡杆菌的安全稳定性却一直是行 业主管部

37、门关注的重点。芽泡杆菌一般都不是动物消化道固有菌，它们发挥作用的原 因至今还没有统一的定论。但是目前人们对两点原因是比较 认可的：产生能杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的抗 菌肽类物质（或者称为细菌素）；消耗环境中的氧气，为乳 酸菌的生长繁殖创造厌氧环境。芽泡杆菌的分离筛选主要也 是依据上述两个原则。安全性评价主要依据抗生素敏感性以及致毒性，相关的技术 都比较成熟。一、样品的采集和初筛与乳酸菌的分离筛选一样，目标芽泡杆菌也是从发生了瘟疫的动物养殖场或者进行攻毒试验幸存的动物体中筛选。1.样品的采集与初筛在发生了大批死亡的养殖场里，我们从土壤和粪便中采集样品，共需采集24个样品，每个样品约 2

38、g,在无菌条件下分别保存在20mL无菌生理盐水中，并用冰块降温，在 12h进 行后续的培养分离，具体方法如下：(1)取0.5ml样品液，加入到5ml的复合营养肉汤(MNB) 中。MNB培养基组成与 pH:葡萄糖：5.0g/L;蛋白月东：5.0g/L;牛肉膏：3.0g/L;醉母浸粉：1.0g/L;MgSO 4 H2O:0.005g/L。 pH:7.0 0.2把上述组分均匀溶解在水溶液中，在120 c消毒30min ,然后冷却到常温，备用。(2)从24种样品中分离得到芽胞杆菌菌株约120株，这些芽泡杆菌均具有革兰氏阳性、过氧化物酶阳性、产生好氧芽抱的特性，但是仅有 6株对E.coliK88具有强烈

39、的抑制作用，它们都基本具备了芽泡杆菌的特性，将此6株菌株编号为：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633 和 MA744 ,并将 这6株作为后续复筛的备选菌种。二、菌种的复筛在芽泡杆菌的复筛过程中，设计了待筛菌与4种指示菌同步混合培养的方法，这种设计的目的：创造丰富的营养条件 便于候选菌株的富集生长；采用指示菌混合培养，给候选 的芽泡杆菌营造一个竞争的环境，有利于产生高抗菌活性的芽抱杆菌，并能在有限的环境中为争夺营养条件，拮抗其他细菌而存活下来。同时在不同的试管中分别接种4种指示菌（见表3.5）,浓度约为 106cfu/mL。表2-54种指示菌及其来源指示菌学名来源金黄色葡锢球菌

40、Staphylococcus IVDC C56005中国兽医微生物菌种保藏中心鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumIVDC中国兽医微生物菌种保藏中心大肠杆菌K88C79-13中国兽医微生物菌种保藏中心大肠杆菌K99Esherichia coli IVDC C83901中国兽医微生物菌种保藏中心Esherichia coli IVDC C83529在上述4个指示菌中，大肠杆菌 K88的抵抗力最强，金黄色 葡萄球菌抵抗力最弱。制备指示菌悬液时，用接种针从斜面上挑取少量的指示菌，分别接种到营养肉汤培养基（MNB）中，37 c培养1824h , 保证菌悬液的浓度为 108cfu/m

41、L左右。接种菌液后，在 37 c混合震荡培养 48h,培养液然后置于 70 c的水浴中保温30min ,杀死营养细胞。存活的芽泡经过 10倍稀释，取一定的稀释液涂布于MNA固体培养基（在MNB培养液中加入1.8%左右的琼脂）平皿表面，使之形成单 菌落。根据菌落形态的差异，挑起产芽泡的、革兰氏阳性的 单菌落，接种到试管斜面中，编号后保存在4 c冰箱中。然后在采用平板扩散的方法，将分离由来的芽泡杆菌用灭菌牙签疏取少许分别点种到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37 c下培养24h,除去部分水份以便于抗菌物质在培 养基中扩散），37 c培养24h,然后把平板倒扣于盛一薄层氯 仿的培养皿盖上并熏蒸约

42、 40min ,以便杀死活细胞并能让菌 落固定于平板的表面，然后移去培养皿盖并让平板里残余的 氯仿挥发30min （以挥发彻底）。在平板表面铺一层刚培养好 的指示菌培养液，均匀布满后倾倒由剩余的菌液，晾干平板,置平板于37 c培养1618h ,观察点种的芽泡杆菌周围抗菌 圈的大小和清晰程度，来判断受试菌对指示菌的抗菌能力。这6种芽泡杆菌当中，MA139对4株指示菌表现由最强的抗菌能力（见表2-6、图2-7 ）。表2-6初分离出6株芽抱杆菌对4株才旨7K菌的抑菌圈直径菌株抑菌圈直径/mmE. coliK88E.coliK99Staph.aureusS.typhimuriumMA2329.8 0.

43、635.6 0.746.80.540.60.8MA13932.0 1.035.9 0.747.50.542.50.7MA35728.2 0.435.0 0.645.40.840.80.7MA55931.30.933.6 0.844.4 1.138.30.9MA63429.6 0.731.5 1.245.60.638.6 1.0MA74431.0 1.033.6 0.645.70.838.4 1.1注：表中值为平均值士标准差*尸1图2-7 MA139对指示菌的抑制作用（A、B、C、D分别代表对大肠杆菌K88、K99、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用）三、芽抱杆菌的抗逆性试验与乳酸细菌的耐

44、受性试验一样，芬抱杆菌也需要进行类似的检验。芬抱杆菌必须在胃肠道存活，同时还必须能够经受住小肠液对菌体的破坏作用，也就是要求芬抱能够抵抗小肠液中的胆盐和 胰液素对它的毒害作用。分别提取生长羊（体重4060kg）的胃食糜和小肠食糜，分别是 用4层无菌医用纱布挤压过滤，取滤液，检验芬抱杆菌的耐受性。生羊胃液中含有的食糜量对胃酸的 pH有很大影响，食糜量越少， 酸度越大。为体现良好的代表性，生羊胃液的样本数可以适当多 一些（通常取10份）混合以后在用纱布挤压过滤。经过筛选出来细菌 MA139,活化两次后接种于 MNB培养基中， 37 c下225r/min震荡培养36h ,将培养液置于 80 c水浴保

45、温 15min,离心收集芬抱（相对离心力为 2500 Xg, 5min ）,菌体用 磷酸缓冲液（PBS:0.144%NaHPO4,0.024%KHPO4,pH7.0）洗涤两 次，最后复溶在PBS缓冲液中，即为菌悬液，用于后续的抗逆耐 受性试验。从试验的结果发现，在胃液中保持3h ,活性芬胞的数量基本没有下降，证明其对胃酸的耐受性很好。在小肠液中，起始 24h 不生长，而24h后开始生长，培养液变得浑浊。在试验的第 5 天，取样染色分析，发现培养液中有大量芬胞增殖。 表明MA139 在小肠液中开始受到了一定的抑制，但是随着培养时间的延长， 能够适应这种环境。表明 MA139的芬抱可以在羊小肠中存

46、活弁 通过营养体增殖。四、芬抱杆菌的鉴定通过上述的分离筛选，我们获得了比较有价值的杆菌MA139,但是这株杆菌还没有经过生理生化鉴定，我们只是从筛选的过程 中体现的发酪特性方面初步认为是芬抱杆菌。在投入应用前，我们必须做严格的鉴定。.形态学鉴定首先进行形态学鉴定，观察其单菌落的形态，弁对活细胞进行革 兰氏染色及芬胞染色。MA139的细胞呈直杆状，芬抱椭圆形近 中生，抱囊不膨大。在 MNA培养基上培养12h,产生黏液，细 胞形态为长杆状；24h后菌落圆形，隆起，表面皱褶，不透明， 干燥；培养至36h,菌体均以休眠体芬抱的形式存在，菌落呈白 色图2-8 (1)。在液体静止培养时有菌膜形成。图2-8

47、.生理生化鉴定形态鉴定结果(图2-8)符合芬胞杆菌的特性，接着进行生理生 化鉴定。生理生化鉴定比较复杂，涉及的操作步骤很多。参照常 见细菌细菌系统鉴定手册中的方法，对试验菌种进行糖醇发酯试验、需氧性测定、V-P试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、 过氧化氢酶试验、柠檬酸盐利用试验、石蕊牛奶试验等。芬抱杆菌鉴定用培养基如下：(1)糖醇发酯培养基及葡萄糖产气试验培养基组成：(NH，)2HPO4 1.0g/L;MgSo 4 7H20 0.2g/L ;酯母浸膏 0.2g/L。配好后加入2%勺澳百里香兰指示剂1mL/L,调节pH为7.2,分 别加入1%勺底物(糖醇或者葡萄糖)，按照底物类型分装试管， 弁将

48、杜兰管口朝下放入试管，115 c灭菌30min。(2)运动型培养基琼脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化钠：5.0/g ;蛋白陈:10g/L。pH7.07.2。121c灭菌 15min。3) V-P试验培养基 蛋白陈：5.0g/L ; K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖: 5.0g/L。pH7.0 0.2o 2mL/支分装试管,121c灭菌 15min。(4)耐盐性试验培养基营养肉汤培养基分别加入 2% 5% 7%10%勺 NaCl,pH7.07.2。121c灭菌 15min。(5)石蕊牛奶试验培养基石蕊乙醇溶液25mL,脱脂牛奶1000mL, 4mL/支分装试管，115 c灭菌 15mi

49、n。(6)柠檬酸盐试验培养基NaCl:5.0g/L; MgSO4 7H20:0.2g/L ;(NH4)H2PO4： 1.0g/L; K2HPO4： 1.0g/L;柠檬酸钠：5.0g/L 澳 百里草酚兰(浓度为4%)。pH6.8 0.2o分装试管，121c灭菌15min。(7)明胶水解培养基蛋白陈：0.5%明胶：10%15%pH7.07.2。分装试管，115 c灭菌20min。(8)淀粉水解试验培养基 可溶性淀粉：20g/L; KNO3: 1.0g/L; NaCl:0.5g/L; K2HPO4: 0.5g/L ; MgSO4 7H2O:0.1g/L ; 琼脂：2.0g/L o pH7.07.2。

50、121c 灭菌 15min。(9)厌氧生长试验培养基营养肉汤培养基，分装厌氧试管，充氮除氧，121c灭菌15min。生理生化试验结果见表2-9 o表2-9试验菌的生理生化试验结果项 目MA139项目MA139葡萄糖发醉+葡萄糖产气-麦芽糖发醉+运动性+棉籽糖发醉+厌氧生长-乳糖发酵+淀粉水解试验+甘露醇发醉+H2O2酶试验+2%NaCl+柠檬酸盐试验+5%NaCl+石蕊牛奶还原+7%NaCl+V-P试验+10%NaCl一明胶液化试验+”为反应阳性；，”为反应阴性。根据生理生化的试验结果，基本可以证明试验菌MA139是芬抱杆菌。3.基因鉴定：16SrRNA分析为了进一步确证生理生化鉴定的可靠性，

51、还可以补充进行基因序列分析。16SrRNA分析是目前比较常用的分析手段。采用基因组DNA提纯试剂盒提取 MAA139基因组DNA,弁以此为模版，选择细菌16SrRNA基因特性引物进行 PCR扩增，弁对扩增产物提纯回收，测定 16SrRNA序列。目前这种试验 在实验设备比较完善的生物研究所实验室都能进行。其结果 证实MA139是枯草芬抱杆菌。五、芬抱杆菌的安全性评价确证了芬抱杆菌的特性，接下来需要考虑其安全性问题。益生菌菌种的安全性是研究开发中必须关注的问题。这其中包括：生产菌种必须属于官方公布允许使用的饲用微生物 菌种；使用的菌种本身必须无毒无害，不会产生任何毒素； 不存在耐药性的质粒或者耐药

52、性基因不存在转移的问题。以下还以枯草芬抱杆菌 MA139为例，简要说明进行芬胞杆菌 安全性评价的方法。安全性试验的靶动物一般都选用老鼠，具体可参考如下方法：选择12只体重基本一致的 SD大鼠(Sprague-Dawley,SD ) 初始体重在200220g比较适合，雌雄各半，分为两个实验 组，一组用5mL芬抱菌悬液(108cfu/mL )注射到大鼠腹腔 中；另一组用5mL生理盐水注射大鼠作为试验对照。注射前 禁食6h。灌服后观察其中毒症状，看是否出现呼吸困难、抽 搐、肢体麻痹等。观察时间为 1周。灌服MA139的芬抱后，所有大鼠均无明显临床症状， 无一死 亡，试验组和对照组间，没有明显差异，证

53、明 MA139安全无 毒。六、抗生素敏感性试验在实际生产中，绝大多数的动物饲料都添加了抗生素，动 物的肠道经常处于抗生素压力之下，这种选择性压力更容易 促进细菌间耐药性基因的传递和转移。所以在选择菌种的时 候，对于哪些携带有可转移耐药性基因的质粒的细菌，从长 远考虑，在生产实际中一定不要采用。在抗生素尚未完全被 益生素类的绿色添加剂完全取代的时候，抗生素有时会与益 生素联合添加，因而在菌株筛选的时候，会人为地筛选出对抗生素具有抗性的微生物应用于实际，这种短期行为也加大 了耐药性细菌扩散和转移的可能。所以，为了确保芬抱杆菌 的使用效果，需要对抗生素的敏感性进行检验。研究结果显示（表2-10 ,图

54、 2-11）, MA139对试验的十种抗 生素的敏感性不一样，对杆菌肽 锌不敏感，对其它的抗生素都有 一定的敏感性，对杆菌肽锌的耐 药性可能与产生杆菌肽的细菌具 有一定的同源性。图2-11 MA139对抗生素的敏感性表2-10MA139对抗生素的敏感性抗生素名称浓度抑菌圈直径/mm结果判定大观毒素Spectinomycin(SPT)100 Ng/片26.5+杆菌肽Bacitracin(B)0.04IU/片0.0-卡那霉素Kanamycin(K)30/片24.1+多黏BPolymyxinB(PB)300/片12.8+吠喃唾酮Furazolidone(FR)300/片21.3+红毒素Erythro

55、mycin(E)15/片24.0+氯毒素Chloramphenicol(C)30/片28.7+四环素Tetracycline(TE)30/片17.7+万古霉素Vancomycin(VA)30/片19.2+利福平Rifampin(RA)5/片27.8+注：+”为敏感；-8为不敏感。从上述分析可以发现，芬抱杆菌的分离筛选远比乳酸菌复 杂，特别是在安全稳定性方面的检验更是极为繁琐。但是这些都是必须完成的工作，在实际生产过程中，任何步骤出现差错都有 可能导致很严重的后果。第三节发酯饲料生产菌种的制备和保存在获得了饲料生产菌种以后，需要对生产菌种进行扩大培养 和保存，在生产中称为制种。生产企业的规模不同

56、，准备生产菌 种的方式也有差别。大型生产企业由于用量比较大，往往自己制种，现生产现用。生产规模比较小的企业倾向于购买菌种，或者 部分购买，部分自己制备。在前期的叙述中，我们已经知道，发酪饲料的生产菌种主要是 乳酸菌、酯母菌和芬抱杆菌。现在就针对这三种微生物的扩大培 养和干燥保存进行论述。一、乳酸菌的培养乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厌氧菌，很难制成干粉，最好现培养现用。乳酸菌培养最简便、最成熟的方式类似酸奶的发酪。在无抗生素 污染的牛奶中加入6.0%8.0%勺糖，经过消毒，冷却至37 c左右， 在无菌条件下接种、厌氧培养，就可以获得比较理想的培养物。以下是在实际生产中采用的乳酸菌扩大培养方法

57、。选取无抗生素污染的纯牛奶 10L,加入600800g白砂糖（也可用红糖代替），加热至6070 C,直至蔗糖完全溶解，然后分装在500mL三角瓶中，用棉花塞塞紧，外包牛皮纸。在 110 c 左右消毒灭菌10min,冷却至37 c左右，接种乳酸菌，这样不 仅可以提高糖酸转化效率，而且乳酸菌培养过程容易控制气压。在3640。恒温培养2024h，就可以用于后续的发酪饲料扩大接种，乳酸菌培养液与发酯饲料的接种比例为0.2%&右。需要强调的是一定要用无抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般对抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的抗生素就会对乳酸的生 长繁殖起到明显的抑制作用，基本不能获得合格的培养物。如果 没有

58、合格的无抗生素污染牛奶，可以用无药物污染的豆粕粉。豆粕经过浸泡、磨浆以后可以替代牛奶，豆粕干物质在溶液中的含 量为8.0炕右，类似于豆浆，其后续的补糖和接种发酪过程与牛 奶发酪过程类似。也可以用无抗生素污染的奶粉 （如新西兰奶粉） 加水调浆（加水量是奶粉分量的8倍左右），恢复成原始牛奶的营养浓度。二、乳酸菌培养液的脱水干燥传统的微生物培养液的干燥都是设法先除去培养液中的自由 水。但是对乳酸菌培养液来说，除水是比较困难的单元操作。乳 酸菌对热和氧气都很敏感，即使是高浓度的乳酸菌培养液， 其含水量一般都超过90%干物质的含量不超过10%除水通常需要 较长的时间。对于厌氧的乳酸菌来说，与空气接触时间

59、越长，活 力损失也越大。采用常规的气流干燥，乳酸菌的活性损失一般都要超过90% 以上。即使采用瞬时喷雾干燥，活力损失也要超过 85%脱水后 的制剂，在20c条件下，在空气中暴露24h,活力损失就会达到 40%iZ上，给实际推广造成很大困难。近年来，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保 存方面进行了大量研究，提出了很多高科技的方法， 其中比较常 用的方法是抽真空冷冻干燥和包埋造粒。但因成本造价高昂，弁不适合工业化生产。下面叙述是比较实用的乳酸菌脱水干燥方 法：一般普通的大麦、小麦和玉米等农副产品的含水量都在14%左右，经过100 c气流干燥以后，可以比较简单地把水份降低到 6%&右。然后

60、再用这些经过干燥的载体以大比例（10倍以上）与乳酸绝培养液混合，使混合物的水份含量为11%20%从而使 乳酸菌处于休眠状态，不易失活。干燥冷却后的载体可以迅速的 吸附培养液中的游离水，然后在真空包装。实验表明，此方法保 存的乳酸菌，在室温条彳下保存3个月，乳酸菌的活力可以保存 50%上，保存6个月时，乳酸菌的活力保存在 40炕右。此方 法简便实用，成本低廉、质量稳定，保质期长，且活性乳酸菌的 回收率较高。（一） 活性乳酸菌脱水干燥流程抽真空密封包装干燥载体一|一混合乳酸菌培养一1（二）流程说明.载体的干燥载体为麦粉、玉米粉或者其他农副产品。粉碎后过20目筛。对载体进行气流干燥，检测其含水量。将