单细胞乔中东

1、单个精子转录组学、基因组学特征及在男性不育诊断中的应用1申 请 人： 乔中东依托单位：上海交通大学 生命科学技术学院协作单位：上海交通大学 医学院附属仁济医院 上海人类基因组研究中心汇报提纲课题的背景及意义研究内容工作基础社会效益和经济效益2汇报提纲课题的背景及意义研究内容工作基础社会效益和经济效益31、社会需求WHO统计表明： 约10的育龄夫妇患有不育症，其中：男性不育占50男性不育中，约有不到15%的原因是明确的，如输精管梗阻、无精、少精、精子发育不良等现行的男性不育的诊断是精液的质量标准超过85%的男性不育原因不明42、指南要求2. 医学科技2.2 单细胞操纵、测序与实时成像技术应用研究

2、2.2.3 单细胞精确操纵与基因组测序新方法在生殖医学领域的应用研究 建立单细胞水平上的精确操纵和控制技术，全基因组完整染色体的单倍型解析，单个生殖细胞 (精子，卵细胞)及胚胎单细胞的全基因组测序及定量分析，应用于遗传疾病的诊断和筛查。53、技术成熟Illumina公司的HiSeq 2500测序平台，测序通量高达600-1000 Gb，可同时完成6-10个样本、测序覆盖度达30倍的人全基因组深度测序测序样品都是大量细胞的混合DNA/RNA样本。微克级甚至毫克级样本量无法满足测序对样品量的需求细胞之间的基因组序列和基因表达存在很大的异质性和差异性，对群体样品或混合样品进行研究得到的结果只是一群细

3、胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息63.1 单细胞测序新方法的诞生2012年发明单细胞全基因组扩增技术美国科学院院士,哈佛大学谢晓亮教授73.2 单细胞全基因组测序的应用8追踪癌细胞2012年，Nature protocol纽约冷泉港实验室与MD 安德森癌症中心单个人精子基因组测序2013年，Cell斯坦福大学单个人卵子基因组测序2013年，Cell北京大学与北医三院人早期胚胎细胞转录组测序2013年，Nature北京大学与北医三院3.3 精子中保留着RNA9成熟哺乳动物精子中RNA的种类和数量基因芯片，第一次获得较完整的人精子转录组序列2002年，Lancet美国韦恩州立大

4、学SAGE技术，对人精子转录组序列进行研究2006年，Human Reproduction上海交通大学RNA-Seq技术，对小鼠精子中的mRNA进行测序2014年，Biology of Reproduction上海交通大学精子中保留下的mRNA可能功能父系染色体组装精子成熟 介导遗传印迹 维持胚胎发育3.4 精子中保留的RNA的可能功能3.5 精子中保留的RNA在胚胎早期发育中的作用11精子RNA潜在的功能部分精子mRNA进入了受精卵2004，Nature美国韦恩州立大学精子中microRNA-34c是受精卵早期发育必需的2012，PNAS香港大学精子传递的Wnt4在受精卵中被翻译2014年，

5、Biology of Reproduction上海交通大学精子中Dby影响受精卵早期发育2010，Asian Journal of Andrology上海交通大学精子中的非编码RNA影响后代的精神状况2014年，Nature日内瓦大学父亲传递给后代的绝不仅仅是基因组DNA那么，男性不育是否与精子中保留的RNA有关？12汇报提纲课题的背景及意义研究内容工作基础社会效益和经济效益131、问题的提出如何从分子水平上诊断男性不育(有需求)是否可以借助单细胞测序技术对单精子进行转录组测序分析(有技术)是否可以根据转录组的测序结果提出诊断男性不育的分子标记(有想法)142、总体目标 对男性不育的精子，进行

6、单个精子的转录组测序并通过生物信息方法，构建正常和不育精子的统一参考数据库；将发现的重要标记物，用于男性不育的诊断和筛查。153、研究内容A 男性不育个体的筛选和小鼠模型的建立 1) 自然环境下男性不育精子标本的筛选; 2) 自然环境下不孕不育小 鼠的筛选; 3) 体外受精; 4) 受精卵体外发育B 单个精子转录组测序C 单个精子的转录组分析 1) 基因表达谱分析; 2) 表达差异基因的功能分析D 单个精子转录组数据的比对分析E 生物标记物在小鼠和患者中的验证F 单个精子转录组图谱在其他遗传病中的应用164、技术路线5、技术难点单个细胞中全部转录本进行非选择性的、均匀的反转录，是实现获得基因表

7、达状态下进行没有序列偏好性测序的前提，转录本的无偏差反转录及扩增是单细胞转录组测序技术的最大难点精子中的RNA量仅占正常细胞的1/600，这是实现单细胞转录组测序的第二大难点186、年度计划本项目计划在3年内完成2015年：收集正常和男性不育的精子、建立单个精子的分选方法、建立单个精子测序的方法 2016年：继续收集男性不育的精子、对单个精子进行测序、运用生物信息学对所得数据进行分析归纳2017年：将获得的生物标记物在临床和小鼠模型上进行验证、总结及成果鉴定197、预期目标1) 建立并优化单精子转录组序列测定方法2) 建立统一的正常和男性不育精子的转录组学学数据库3) 筛选出2-3个可应用于临

8、床诊断男性不孕不育的标记物，并在临床和动物上予以验证4) 申请国内外专利1-2项，发表SCI论文3-5篇6) 培养青年科学家2-3人和硕士博士研究生各2人20汇报提纲课题的背景及意义研究内容工作基础社会效益和经济效益21乔中东课题组长期从事精子中转录组学的研究发现精子中保留的RNA参与了胚胎早期发育发现精子中的microRNA对后代有影响22 2012年与仁济医院李铮课题组合作对一些不育的人精子样本(符合WHO正常精子标准)进行蛋白组和转录组的研究232013年与上海人类基因组研究中心王升跃课题组合作对正常小鼠和人精子转录组进行测序，并通过数学模型估算出每条精子中可能存在的mRNA数量和种类2

9、4上海市辅助生殖与优生重点实验室 卫生部行业规范化示范精子库基地申报专利24项，发表SCI论文31篇 李铮课题组从事临床男科学研究25不育精子症患者病例信息采集流程26临床资料登记（纸质）手术记录培养结果样本库电子档案（电子化）王升跃/李冲课题组长期从事基因组测序上海人类基因组研究中心拥有国际一流的测序技术平台和遗传性疾病分子分型技术平台进行了大量的全基因组、全外显子、目标区域基因组学和转录组学的研究，及DNA甲基化和miRNA等表观遗传学等测序工作在Nature, Science, Nature Genetic, Genome Research, PNAS等杂志发表SCI论文130多篇，申报

10、发明专利494项，获得发明专利24项获得国家和上海市等科技奖励38项27南方中心高通量测序技术平台测序技术系统测序通量Gb/run读长测序时间/run454 GS FLX+0.7500-1000 bp1 天HiSeq 2500600/1002X100/2X150 bp8/1 天 PacBio RS II38.5/32 kb1天454 GS FLX 2007./2011HiSeq 2500 2011/2013PacBio RS II 2013第三代单分子实时测序技术南方中心大规模快速数据存储和分析计算机系统计算: 300核内存: 共4T(3T为共享内存用于大规模拼接)存储: 300T 高速磁盘阵

11、列(40Gb 高速互联)网络: 核心节点40Gb Infiniband高速互联和 辅助千兆以太网双网络三个课题组优势互补项目申请人及其合作者长期从事男性生殖的基础和临床研究工作、基因组和转录组序列分析及生物信息分析等工作，积累了丰富的研究经验。我们将依托上海交通大学附属仁济医院的上海人类精子库、上海交通大学分析测试中心、上海人类基因组研究中心等具有的一流科研工作条件，充分利用三个团队互补的优势，以保障本项目的顺利实施。29项目分工上海交通大学乔中东课题组自然环境下不育小鼠模型建立单精子转录组测序测序数据分析、比对及男性不育标记物的筛选临床上指标正常但不育精子样本收集在不育样本中验证筛选出的标记物将标记物应用于男性不育的诊断上海人类基因组研究中心王升跃课题组仁济医院李铮课题组经费预算及分配本项目申请国家经费200万元。依据各参与单位的研究任务，预算如下： 上海交通大学120万元 上海人类基因组研究中心80万元31汇报提纲课题的背景