细胞化学染色检验血液检验的课件

1、第二节 细胞化学染色检验本节主要内容：一、铁染色二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色三、过氧化物酶染色掌握细胞化学染色临床应用掌握各种细胞化学染色的原理及临床意义熟悉各种细胞化学染色结果判断及正常血细胞染色反应了解细胞化学染色的基本步骤要求：一、概念 细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质(酶类/脂类/糖类/铁/蛋白质/核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。第一部分 概 述二、必要性从形态学观察，存在较多的主观性；有些原始细胞形态较相似，难以鉴别；结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。三、临床应用 1. 辅助判断急性白血病

2、的细胞类型 2. 辅助血液系统疾病的诊断和鉴别 诊断 3. 观察疾病的疗效和预后 4. 疾病发病机制的探讨 白血病的诊断：MICM分型 M：morphology I：immunology C：cytogenitics M：molecular biology形态学分型：进行初步的诊断免疫学分型：明确细胞种类细胞遗传学分型：与疾病预后有关分子生物学分型：提高到分子水平四、基本步骤（1）物理法：干燥、火焰（2）化学法： A、蒸气固定： B、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇。 1. 固定（1）偶氮偶联法：酯酶染色（2）联苯胺法：POX（3）普鲁士蓝反应：Fe（4）雪夫反应：PAS（5）金属沉淀法：NAP（6

3、）物理显色法：SBB2. 显示：有色沉淀反应铁染色-中性红、伊红PAS-甲基绿3. 复染：使各种细胞能显示出来核：中性红、甲基绿、沙黄等。浆：伊红、刚果红、光绿等。 第二部分 具体细胞化学染色方法 铁染色(Ferric stain) 骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒(外铁)和幼红细胞(内铁)中；检测采用普鲁氏蓝反应。一、原 理 4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 Fe4Fe(CN)63 + 12K+ 含铁物质 亚铁氰化钾 亚铁氰化铁酸性二、结果判断1. 细胞外铁(骨髓小粒含铁血黄素)铁颗粒、铁小珠、铁团块细胞外铁(低倍镜观察)（）：无颗粒（）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠（）：有较多的铁颗粒或铁

4、小珠（）：有很多的铁颗粒、铁小珠 和少数铁小块（）：有极多铁颗粒、小珠和 很多铁小块，密集成堆。+（1）分级(按铁颗粒数量的多少及大小) 细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清。 粗大颗粒：很容易看清的颗粒。（2）阳性率 观察100个中晚幼红细胞，计算出铁 粒幼红细胞的百分比。2. 细胞内铁(中晚幼红细胞，油镜观察) 细胞内铁(油镜观察幼红细胞)型：12个小铁颗粒；型： 35个小铁颗粒； 型： 610个小铁颗粒或14个大颗粒； 型： 10个以上小铁颗粒或5个以上大颗粒。 环形铁粒幼红细胞(ringed sideroblast) 幼红细胞胞质内铁颗粒6个，围绕 核周1/2以上者。 铁粒幼红细胞(sid

5、eroblast)： 胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。 铁粒红细胞(siderocyte)： 胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞1. 细胞外铁： （ + ） （ + ）2. 细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约 1944%， III型（ I型为主），无 型、型、环形铁粒幼红细胞及铁粒 红细胞。三、参考范围四、临床意义1. 缺铁性贫血： 外铁（），内铁15%。4. 非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、 白血病等，内外铁常增多。5. 感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等： 外铁增多。五、应用评价 铁染色是临床常用的一种细胞化学染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但

6、是反映机体储存铁的金标准。 外铁：反映骨髓中铁的储存量；内铁：反映骨髓中可利用的铁量。 中性粒细胞碱性磷酸酶染色neutrophilic alkaline phosphatase （NAP）-磷酸萘酚钠-萘酚+磷酸钠NAPPH9.6-萘酚+重氮盐不溶性沉淀定位于胞质 Kaplow偶氮偶联法：一、原 理二、正常血细胞染色反应NAP主要存在于成熟的中性粒细胞胞质中。严重的化脓性感染时，晚幼阶段粒细胞也可见有阳性反应。其他细胞基本呈阴性反应。三、结果判断及参考范围 1. 结果判断：出现深褐色颗粒的量及密度 NAP染色反应强度标准：（）：胞质中无颗粒；（）：胞质含少量颗粒，约占1/4；（）：胞质含中等

7、量颗粒，约占1/2； （）：胞质含较多颗粒，约占3/4； （）：胞质充满颗粒，无空隙。+EOS 钙 钴 法 NAP染色结果报告包括阳性率和积分值。 阳性率：指计数100个中性成熟粒细胞，其阳性细胞的数量即为阳性率；积分值：指计数100个中性成熟粒细胞，不同阳性程度细胞数量乘以其阳性程度之和即为积分值，其计算公式为：积分值=()数量1 +()数量2 +()数量3 +()数量4。 2. NAP染色结果报告： 3. 参考范围： 中性粒细胞NAP阳性率：40% NAP积分为： 30130分NAP染色结果既报阳性率又报积分值。四、临床意义1.生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。 2.病理性变化： (1

8、)NAP：细菌性感染、慢粒(加、急)、急 淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、 骨纤、真红、再障、原发性血小 板增多症、使用糖皮质激素等。3. 疾病的鉴别： (1) 类白与慢粒: 前者 后者 (2) 慢粒慢性期与慢性中性粒细胞白血病： 前者 后者 (3) 细菌性感染与病毒性感染/寄生虫感染： 前者 后两者正常或(2)NAP：慢粒(慢)、PNH、MDS、恶组等。(6) 恶组与反应性组织细胞增多症： 前者 后者常(7) 急性白血病类型： 急性髓细胞 急淋(4) 慢粒病情观察： (5) 再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿： 前者 后者CML类白五、应用评价 NAP染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐 Kap

9、low萘酚AS-BI磷酸钠法和Tomonaga萘酚AS-MX 磷酸钠法。钙-钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应 时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色 泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚AS-BI磷酸钠法最为 广泛使用，利于评定NAP活性强度的分级。常用重氮 盐有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等，不同偶联 有不同的灵敏度。 过氧化物酶染色 (peroxidase，POX)一、原 理 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶(POX)，它可分解H2O2释放出新生态的氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于胞质内酶活性部位。 二氨基联苯胺法二盐酸联苯胺法二、结果判断 在细胞

10、质内出现金黄色颗粒为阳性反应。二氨基联苯胺法二盐酸联苯胺法 复方联苯胺法三、正常血细胞的染色反应 1. 粒细胞系统： 原始粒细胞（）或（+） 早幼粒以下细胞均（+），阳性逐渐增强。 中性分叶核粒细胞：强阳性 嗜酸粒细胞：阳性最强 嗜碱粒细胞：（）2. 单核细胞系统：（）或弱（+），阳性颗粒少而细小。3. 其它系统细胞： 淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核细胞系统、浆细胞、组织细胞（）。 四、临床意义主要用于鉴别急性白血病的类型（1）急淋和急性髓细胞系的鉴别：急淋：（），阳性率3%；急单：弱阳性；急粒：阳性（ + + + + ）。 ALLALL原粒阴性原粒弱阳性原粒阳性 早幼粒 强阳性 （2）鉴别诊

11、断： a. 小原粒（+）与原淋（） b. 急性早幼粒白血病(+)与急单（+） c. 急单（+）与组织细胞白血病、 恶性组织细胞病（）一、原理 苏丹黑B是一种脂溶性重氮染料，可溶解细胞内含脂结构(中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色(粒细胞：丰富；单核细胞：少量)。 苏丹黑染色（Sudan black B，SBB）二、SBB与POX区别： POX特异性高于SBB，而敏感性 低于SBB；2. SBB步骤较繁琐。过碘酸-雪夫反应(糖原染色) periodic acid-Schiff reaction(PAS) 过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基的多糖类物质(糖原、糖蛋白

12、、糖脂、粘多糖等)氧化，形成双醛基。醛基与Schiff s液中的无色品红结合，使无色品红变成紫红色化合物，定位于含多糖类的细胞内。一、原理 1. 粒细胞系统：（阳性逐渐增强） 原始粒C（）或（+） 早幼粒C成熟中性粒C（+）： 细颗粒均匀红色 嗜酸粒C：颗粒不着色，胞质呈红色。 嗜碱粒C：颗粒阳性，胞质不着色。 二、正常血细胞的染色反应2.单核细胞系统：分化差（）其他（+）， 细颗粒状。3.淋巴细胞系统：多数（）少数（+）， 粗颗粒或块状。4.红细胞系统：（），病理情况可（+）。5.巨核细胞系统：（+），颗粒状或块状。6.其它细胞：浆细胞（），巨噬细胞（+）a 粒细胞、b 巨核细胞、c 单核细

13、胞、d 幼红细胞三、结果判断1. 粒细胞系统： 红色、弥散状。各种细胞阳性反应强弱不同 2. 淋巴细胞系统： 粗颗粒状、小块状、大块状红色。1、+ 2、+ 3、+ 4、+ 5、3. 红细胞系统： 均匀红色或块状 4. 单核细胞系统： 细颗粒状 5. 巨核细胞和血小板： 颗粒状、块状。1.巨核细胞和血小板阳性 1. 帮助鉴别巨幼细胞性贫血和骨 髓增生异常综合征、红白血病: 前者（），后两者（+）。四、临床意义 A 红白血病(+) B 巨幼细胞性贫血() 2. 帮助鉴别急性白血病的细胞类型： 急淋：（+）呈粗颗粒状或块状。 急粒：（+）细颗粒状或均匀红色。 急单：（+）细颗粒状，均匀分布， 有时胞

14、质边缘颗粒较粗大。 3. 其他细胞： 急慢性淋巴细胞白血病和 淋巴瘤细胞多呈强阳性 戈谢细胞呈强阳性 尼曼-皮克细胞多呈阴性CLLALL 1. 特异性酯酶（specific esterase） 主要存在于粒细胞，又称“粒细胞酯酶” 氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）。 一、分类酯 酶 染 色 2.非特异性酯酶(nonspecific esterase) 单核、组织细胞中含量较多，粒细 胞、淋巴细胞中含量少，且氟化钠抑 制单核细胞中的非特异性酯酶，而不 抑制粒细胞、淋巴细胞及其他细胞。醋酸AS-D奈酚酯酶： NAS-DAE-醋酸奈酚酯酶： - NAE-丁酸奈酚酯酶： - NBE酸性-醋酸奈

15、酚酯酶：ANAE(- NBE 敏感性不如NAS-DAE但特异性较之强) （一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 Naphthol AS-D chloroacetate esterase 1. 原理 氯乙酸AS-D萘酚 AS-D萘酚 不溶性的有色(红)沉淀。 NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高， 因此又称为“粒细胞酯酶” NAS-DCE 重氮盐(坚牢蓝紫酱) 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 2. 正常血细胞的染色反应 粒系(酶活性随细胞成熟而逐渐减弱) 原粒（）或（+） 早幼粒成熟中性粒细胞（+ ） 嗜酸性粒细胞（）或弱（+） 嗜碱性粒细胞（+）单核细胞系统： （）肥大细胞：（+）淋巴细胞、浆细

16、胞、幼红细胞、 巨核细胞、血小板： （） 3. 临床意义主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型：急性粒细胞白血病： （+）急性早幼粒细胞白血病：强（+）急性单核细胞白血病：（） 急粒单：粒细胞（+）和单核细胞（）急性巨核细胞性白血病：（）急性淋巴细胞白血病：（） 1. 原 理 非特异性脂酶在相应的pH环境中， 将基质液中相应底物水解，产生含萘酚 的物质，后者与重氮盐发生偶联反应， 形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质 内酶所在的部位。（二）非特异性脂酶染色根据pH值的不同分为：酸性：酸性- 醋酸萘酚酯酶染色(ANAE)中性：- 醋酸萘酚酯酶染色(- NAE) 醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE

17、)碱性：-丁酸萘酚酯酶染色(- NBE) 名称pH底物生成物重氮盐(产物颜色)-醋酸萘酚酯酶(-NAE)中-醋酸萘酚-萘酚坚牢蓝B棕黑,灰黑醋酸AS-D萘酚酯酶 (AS-D NAE)中醋酸AS-D萘酚AS-D萘酚坚牢蓝BB蓝-丁酸萘酚酯酶(-NBE)碱-丁酸萘酚-萘酚坚牢紫酱GBC红酸性-醋酸萘酚酯酶(ANAE)酸-醋酸萘酚-萘酚六偶氮付品红红-醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色)-醋酸萘酚酯酶染色a:单核 b:BPC c:巨核 d:LC(+) e:幼红(-)2. 临床意义 辅助鉴别急性白血病细胞类型 A . 急单：单核细胞阳性，能被NaF抑制。 B . 急粒：粒细胞弱阳性，不被NaF抑制。C.

18、 M3：强阳性，不能被NaF抑制。D. M4：部分阳性细胞能被NaF抑制， 部分阳性细胞不能被NaF抑制。E. ALL：原幼淋阴性或阳性，不能被NaF 抑制。氟化钠抑制：氟化钠试验的抑制率大于50%。公式：NaF抑制率= 抑制前阳性率 抑制后阳性率 抑制前阳性率(或阳性积分)100%-醋酸萘酚酯酶染色M5NaFM1NaF酸性-醋酸萘酚酯酶染色（弥漫性棕红色）-M5 3. 酯酶双染色 在同一张涂片上进行两种酯酶染色特异性酯酶 + 非特异性酯酶对诊断急性粒-单细胞白血病有独特价值-NAE 与NAS-DCE 红色(单)-NBE 与 NAS-DCE 兰色(粒) NAS-DCE： M1弱(+)/M2 (

19、+) /M3强(+)，M5/ALL()； -NBE： M5(+) NaF抑制，M1/M2/M3/ALL()； -NAE / NAS-DAE： M5强(+) NaF抑制 M3强(+) /M1M2a/ALL(+) NaF不抑制。 酸性磷酸酶染色(acid phosphatase，ACP)一、原理1.Gomori 硫化铅法棕黑色pH5.02. 偶氮偶联法(常用) 六偶氮付品红棕红色沉淀 磷酸萘酚AS-BI 萘酚AS-BI 棕红色沉淀 ACPPh5.0重氮盐3. 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一组同工酶）两张相同标本涂片+两份基质液(加L-酒石酸，不加 L-酒石酸) ACP染色耐L-酒石酸两份（+）不耐L-酒石酸不加 L-酒石酸（+）加L-酒石