液相色谱实用技术色谱柱的使用及保养

1、液相色谱实用技术色谱柱的使用及保养良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（二）流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配

2、溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线过滤器In-Line Filter，部件号 WAT084560防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）可更换的消耗品更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs)更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)保护柱可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱Waters的部件号，WA

3、T084550，用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大Guard-Pak预装保护柱Waters的部件号，WAT088141有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低可换芯式保护柱新型的保护柱 Sentry Guard适应的用户类型非常脏, 非常复杂的样品本底生化样品, 溶液环境样品食品不想作太多的固相萃取不想降低柱效新型的保护柱 Sentry GuardSentry Guard 的特点特点高质量, 高效填料 - 不损失柱效增加分析柱效 - 增加适应范围20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套 - 适用于所有的HP

4、LC柱(3.9及4.6内径)整体式（对Waters柱）- 使用方便，容易各种不同填料配合Waters柱Sentry Guard 的规格产品描述3.920mm柱长适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换可换柱芯式设计，提供各种填料:BondaPak: C18, phenyl, CN, NH2, SilicaNova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, SilicaResolve: C18, C8, SilicaDelta-Pak: C18, C4Symmetry:C18, C8色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂

5、质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐 合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低柱压过高 为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱效低为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产

6、生裂缝柱床收缩或干枯重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附色谱柱以外的因素（一）“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大色谱柱与仪器的联接除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏解决办法：自制相应的转换接头使用“通用”型接头（锥箍及螺母）这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从P

7、hase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。Waters色谱柱的联接Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其 stop-depth 为0.090英寸不同的Stop-Depth长度色谱柱以外的因素（二

8、）柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误?色谱柱以外的因素（三）实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法的开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足简单的判别方法高的柱反压是否伴随着保留时间变化? 峰形变坏? 分辨率变坏? 测量色谱系统的谱带展宽典型的分析系统应远小于 100 微升如大于此数应检查仪器系统测量色谱系统的谱带展宽卸下色谱柱，用UNION代替之按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约25微升用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽

9、：W仪器参数流速1.0 ml/min纸速20 cm/min (用记录仪时，接检测器10mV档)检测器灵敏度0.5-1.0AUFS (用记录仪时)检测器时间常数小于0.2谱带展宽（ml）=1000W（cm）/20（记录仪）=1000W（min） （工作站）判断故障与故障排除的原则规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实存在。规则二一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联。规则三恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则，换下的组件将来很难再利用，会造成浪费。规则四尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故障排除

10、经验来改善您目前的预防保养工作，使现有问题再发率降至最低。规则五养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行故障排除的关键。流动相及样品的预处理液相色谱实用技术（二）液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化流动相脱气的方法加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤

11、的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机可保持连续脱气，多用于低压梯度样品的预处理样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护样品的预处理重要性占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤样品预处理常用的方法高速离心过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱其他样品预处理的过程去除微粒过

12、滤过滤膜/过滤装置有机(0.5m)/无机(0.45m)膜片可更换一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000g超滤机理超滤是一种基于分子量分离的技术目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐选择性沉淀常用于生化样品中除蛋白有机溶剂乙腈，甲醇强酸三氯乙酸，过氯酸盐50% 硫酸铵10% TCA样品衍生提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子氨基酸分析

13、样品衍生氨基酸分析AccQ-Tag 衍生法浓缩样品浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱Oasis小柱Sep-Pak小柱固相萃取（SPE）技术固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份固相萃取技术（SPE）的重要性实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上加速样品的制备时间降低样品前处理的成本提高分析的准确性及回收率更容易自动化减少样品处理步骤降低对不稳定样品的影响提高安全性新一代固相提取小柱 OasisHLB亲水-亲脂平衡共聚物“亲水”使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角“亲脂”提供对被分析物质的反相保留能力NO亲水性

14、单体 N-乙烯基吡咯烷酮亲脂性单体 二乙烯基苯特征一，水湿性优势即使小柱在固相提取过程中干枯，也能吸附被分析物质益处 即使小柱在固相提取过程中干枯，也能获得高回收率(85%) 提取板及小柱可获得一致的回收率(RSDs5%) 容易使用Oasis HLB 固相提取小柱C18与Oasis HLB 吸附剂浸润能力的比较HLHLHLHLHLHLLLLLLLLLLLLL HLBH = 亲水单元L = 亲脂单元C18特征二，通用型吸附剂优势: 在很宽极性范围内保留酸性、碱性及中性化合物样品不会穿透小柱益处: 对极性化合物可获得较高回收率使用同一方法，提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率一种吸附

15、剂适用于大多数SPE提取过程Oasis HLB固相提取小柱结果: 通用型吸附剂020406080100AcidsNeutralsBases% 回收率Ibuprofen (2.5 ?g)Naproxen (2 ?g)Salicylic Acid (5 ?g)Sulfadiazine (10 ?g)Sulfamerazine (10 ?g)Acetaminophen (0.5 ?g)Theobromine (0.5 ?g)Paraxanthine (0.5 ?g)Theophylline (0.5 ?g)Caffeine (0.5 ?g)Procainamide (0.5 ?g)Ranitidin

16、e (0.5 ?g)Oxycodone (1 ?g)Propranolol (4 ?g)Naltrexone (1 ?g)Salbutamol (2 ?g)Doxepin (4 ?g) Spiked Serum on 1 cc 30 mg Oasis HLB Cartridges特征三，非常容易预测的保留行为优势: 可任意调节处理过程中的pH值充分利用反相保留特性益处: 便于优化提取方法Oasis HLB固相提取小柱Oasis HLB ：优化的提取方法Oasis HLB 固相提取小柱特征四，重现性Oasis HLB吸附剂填料在Waters ISO 9002-认可的工厂中生产 确保重现性. 优势

17、每批吸附剂进行严格的质量控制，建立SPE填料重现性的新标准 益处:每盒产品附带合格证书不同批次具有重现的回收率Oasis 不同批次间重现性Batch ABatch BBatch C0.96% 1.21% 2.02% 3.66% 2.40% 3.06% 3.67% RSD020406080100% RecoveryProcainamideRanitidineAcetaminophenPropranololDP-phthalateDoxepinb-Methasone Valerate新型Oasis HLB MCX 吸附剂 填料组成MCX - Mixed-mode Cation eXchangerO

18、asis HLB 填料上键合阳离子交换基团(HSO3) Oasis MCX的保留机理:HLB 提供反相保留能力磺酸基提供阳离子交换能力 Oasis MCX的优势方法简单-无需活化与平衡对碱性化合物具有高选择性适于分别提取不同性质的化合物Oasis HLB -应用各种药物提取，尤其是生理体液中的药物， 如血浆、尿液中的药物等天然产物提取农业化学应用，如提取除草剂、杀虫剂等环境化学应用，如提取多环芳烃等Waters的Sep-Pak小柱Waters专门开发了固相萃取技术（SPE）Sep-Pak小柱的应用领域除去杂质及干扰组份把样品分成不同极性的组分析富集微量的组份Sep-Pak小柱的主要种类反相正相

19、离子交换Sep-Pak的种类根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱各种Sep-Pek小柱（一）正相包括Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡加入样品用非极性溶剂洗脱不想要的组份用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如NH2 / CN确认回收率各种Sep-Pek小柱（二）反相包括C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CN可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了样品溶解在强一些极性的溶剂中加入样品用强极性溶剂洗脱不想要的组份用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份确认回收率各种Sep-Pek小柱(三)离子交换包括Accell Plus CM / Accell Plus