鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞SMMC-7721抑制作用

1、鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞 SMMC-7721抑制作用邓轶韬1，丁玉梅1，李华亮1，2，董欣2，沈雪莹1，陈清西1*（1厦门大学生命科学学院，厦门361005；2广州鼍龙生物技术开发有限公司）摘要 本文研究了鳄胆素（crocodile choline）联合阿霉素（doxorubicin）对人肝癌细胞SMMC-7721的体外抑制作用以不同浓度鳄胆素、阿霉素单用药组和两药联合用药组作用SMMC-7721细胞，应用MTT法和集落形成实验检测细胞增殖抑制、流式细胞仪分析细胞周期分布、Western blot检测凋亡相关蛋白表达结果显示鳄胆素、阿霉素单药与联合均能抑制SMMC-7721细胞的增殖，且呈

2、剂量依赖效应，两药联合有协同效应（P0.01）集落形成实验中对照组、鳄胆素单用药组和阿霉素单用药组的克隆形成率分别为88%、30.8%和28.5%，而两药联合后几乎没有克隆形成，表明两药联合有显著的差异细胞周期分析显示药物处理组出现S期阻滞，联合组与对照组相比，S期细胞含量由12%上升到59%；各组均能诱导SMMC-7721细胞凋亡，并以联合组效果更佳，细胞核经Hoechst染色出现浓染致密的固缩形态和强蓝色荧光;细胞中促凋亡蛋白Bax表达上调诱导细胞凋亡研究结果表明鳄胆素与阿霉素联合对人肝癌细胞SMMC-7721有显著的抑制作用，作用效果具有协同效应本研究有望为肝癌的联合用药治疗提供理论依据

3、关键词：鳄胆素；阿霉素；联合用药；肝癌；细胞凋亡中图分类号：Q 3561 文献标识码：A* 通讯作者： HYPERLINK mailto:chenqx chenqx （陈清西）基金项目： 厦门市科技计划项目：3502Z20133009，国家自然科学基金委基础科学人才培养基金科研训练及科研能力提高项目(厦门大学)（基金号：No.J1310027）和厦门大学生物学科拔尖计划项目资助 肝癌在全球范围内是一种发生率和致死率都很高的癌症，随着现代社会的发展，由于水资源污染等造成肝癌的发生率居高不下，在中国的东南沿海一带更是如此 ADDIN EN.CITE ElSerag20071369113691369

4、17ElSerag, Hashem B.Rudolph, K. LenhardHepatocellular Carcinoma: Epidemiology and Molecular CarcinogenesisGastroenterologyGastroenterologyGastroenterology2557-2576132720070016-5085/science/article/pii/S0016508507007998/10.1053/j.gastro.2007.04.061 HYPERLINK l _ENREF_1 o ElSerag, 2007 #1369 1肝癌的临床治疗主

5、要是手术、放化疗与中药结合的方法治疗阿霉素是临床常用的化疗药物，也是肝癌的推荐用药但阿霉素对正常细胞会产生一定的杀伤作用，造成较严重的心脏毒性和骨髓抑制作用，在临床上的应用受到了一定的限制 ADDIN EN.CITE Qian2011137021370137017Qian, HaoranYang, YiWang, XianfaCurcumin enhanced adriamycin-induced human liver-derived Hepatoma G2 cell death through activation of mitochondria-mediated apoptosis an

6、d autophagyEuropean Journal of Pharmaceutical SciencesEuropean Journal of Pharmaceutical Sciences125-131433CurcuminAdriamycin (doxorubicin)Hepatoma G2 cellsMitochondriaApoptosisAutophagy20110928-0987/science/article/pii/S0928098711000972/10.1016/j.ejps.2011.04.002 HYPERLINK l _ENREF_2 o Qian, 2011 #

7、1370 2药物联合可以减少用药剂量和增加疗效，从而降低药物的副作用，并且能避免机体对其产生耐受目前已有关于阿霉素联合其他化疗药物抑制肝癌细胞的报道 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_3 o Huynh, 2007 #2 3, HYPERLINK l _ENREF_4 o Jin, 2010 #1 4，但是通过添加另一种化疗药物来降低阿霉素的用量可能会来给机体其他的伤害，阿霉素与天然药物的联合将可能真正降低化疗药物的副作用随着中药研究的发展，动物胆汁在医药上的应用愈发受到重视，中国药典已收载的动物胆汁制剂达到20多种鳄胆汁是

8、由20种以上的胆汁酸、胆汁醇及中性的甾醇类组成 ADDIN EN.CITE Tint1980137151371137117Tint, GSDayal, BishambarBatta, Ashok KShefer, SarahJoanen, TedMcNease, LarrySalen, GeraldBiliary bile acids, bile alcohols, and sterols of Alligator mississippiensisJournal of lipid researchJournal of lipid research110-11721119800022-2275

9、HYPERLINK l _ENREF_5 o Tint, 1980 #1371 5，本实验室利用生化方法从暹罗鳄胆汁中分离提取到的有效成分命名为鳄胆素，对胆管癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞有良好的抑制作用 ADDIN EN.CITE 137261372137217 HYPERLINK l _ENREF_6 o , #1372 6两者联合使用还未见报道本研究探讨鳄胆素、阿霉素单独及联合作用对肝癌SMMC-7721细胞的体外抑制作用，初步探索两药单独及联合作用时的药效变化，以期减少化疗药物的用量，降低对机体的毒副作用，达到增效减毒目的，为药物的临床联合应用提供理论依据和支持1 材料与方法材料鳄胆素由

10、本实验室从暹罗鳄胆汁中提取分离，用100% DMSO溶解，-20 保存，实验时稀释，DMSO终浓度1%；阿霉素购自上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Hyclone公司； MTT购自Sigma公司；人肝癌SMMC-7721细胞由厦门华侨亚热带植物引种园惠赠实验方法细胞培养及分组人肝癌SMMC-7721细胞培养在内含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养基（pH 7.2），37 ，体积分数为5% CO2培养，取对数生长期细胞用于实验根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即对照组，鳄胆素、阿霉素单独用药组和鳄胆素

11、、阿霉素联合用药组鳄胆素单独用药组的终浓度依次为5、10、15、20 g/mL；阿霉素单独用药组的终浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 g/mL;联合组用药组的最终浓度依次为：阿霉素（0.2、0.4、0.8和1.0 g/mL）+鳄胆素（5 g/mL），阿霉素（0.2、0.4、0.8和1.0 g/mL）+鳄胆素(10 g/mL)和阿霉素（0.2、0.4、0.8、10 g/mL）+鳄胆素（15 g/mL）MTT法测定鳄胆素和阿霉素单独或联合作用对SMMC-7721细胞增殖的影响用MTT法测定鳄胆素单药组、阿霉素单药组和两药联合组对SMMC-7721细胞的抑制率取对数生长期的细胞以61

12、03/孔密度接种于96孔板，每个浓度设置4个重复，每孔加入200 L细胞悬液，置于CO2培养箱中培养24 h后，分别加入2 L不同浓度的药液，对照组加入相同体积的DMSO，继续培养24 h后加入20 L MTT溶液（5mg/mL），培养4 h，弃上清液，每孔再加入150 L二甲基亚砜（DMSO），37 充分溶解后，用酶标仪测定吸光度，测定波长为490 nm按下式计算抑制率：抑制率（%）=（对照组OD值实验组OD值）/对照组OD值100%药物联合作用评价采用金氏公式q=Eab/(Ea+Eb)-EaEb判断两药不同药物浓度相互作用是否具有协同作用，式中Eab为合用药物的抑制率，Ea、Eb分别为a药

13、、b药单独用药的抑制率若q值在0.851.15内为两药合用单纯相加，q值1.15为有协同作用，q值0.85则表示两药合用有拮抗作用集落形成实验取对数生长期的SMMC-7721细胞，分别以每孔2000个细胞接种于60 mm的培养皿中，待细胞贴壁后，分别用鳄胆素、阿霉素及两者联合处理细胞24 h;接着撤走药物刺激，用含10%胎牛血清的正常RPMI培养基继续培养2周除去培养基，PBS洗2遍，无水甲醇固定，结晶紫染色，统计集落形成数并拍照Hoechst33258荧光染色观察取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞接种于6孔板中，每孔含多聚赖氨酸处理过的盖玻片，细胞贴壁后加入药物作用48h实验分为对照组

14、、鳄胆素及阿霉素单药组、鳄胆素和阿霉素联合组取长有对照组细胞核处理组细胞的爬片，预热的PBS洗3次，然后用固定液（甲醇：乙酸 = 3:1）固定10 min，PBS洗3次，滴加10 g/mL Hoechst 33258染液室温避光孵育10 min，PBS洗3次，稍微晾干，用含有抗淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察并拍照细胞周期测定将培养至对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞按1105 ml-1接种于100 mm 培养皿中，培养24 h后加入药物药物处理24 h后收集细胞，4 800 r/min离心5 min，PBS洗2次后加入 -20 预冷的体积分数为70%乙醇固定，4 过夜细胞上机检测前低

15、速离心除去乙醇，PBS洗涤2次，每管分别加入500 L PBS重悬细胞，然后加入10 L 10 mg/mL RNase A，37孵育30 min,转入冰浴，加入25 L 碘化丙啶（PI）染液 (10 mg/mL)，染色30 min,300目绢筛过滤，于EPICS XL型流式细胞仪中进行检测，所得数据用ModFit LT 3.3软件进行细胞周期分析细胞内总蛋白的提取及免疫印迹取处于对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，经过不同浓度的药物处理48 h后，离心（1000 r/min, 5 min）收集贴壁和悬浮的所有细胞，PBS洗1次，离心，弃上清，加入预冷的细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀，冰

16、上裂解30 min,每10 min漩涡震荡一次；4 , 13000 r/min,离心10 min，取上清用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，用PBS调节蛋白浓度使每管总蛋白浓度相同每管加入等体积的5Loading buffer上样缓冲液，沸水中煮沸5 min使蛋白变性，取20 g总蛋白上样，12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭，TBST（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.2, 150 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20）缓冲液洗膜3次，每次10 min，一抗孵育过夜，相同方法洗膜，加入HRP标记的

17、二抗孵育1 h，相同方法洗膜后，滴加ECL化学发光底物于PVDF膜上，在暗室中进行胶片曝光、显影和定影结果与分析MTT实验结果MTT实验结果显示，鳄胆素、阿霉素单药组和联合作用组对SMMC-7721细胞都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强单独作用24 h时，鳄胆素对SMMC-7721细胞的IC50 = 22.28 g/mL，阿霉素对其IC50 = 1.17 g/mL两者联合作用时，低浓度鳄胆素（5 g/mL）与不同浓度阿霉素合用，其联合作用呈拮抗作用；中浓度及高浓度鳄胆素与不同浓度阿霉素组合，其联合作用由相加转变到协同作用由表1可以看出，鳄胆素为15 g/mL、阿霉素为

18、0.4 g/mL时，两者协同作用最为显著，达到相同作用效果时能显著降低阿霉素的浓度，降低阿霉素所产生的毒副作用后续实验均采用这一浓度组合（鳄胆素15 g/mL、阿霉素为0.4 g/mL）表1 鳄胆素与阿霉素联合作用对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用Table. 1 Inhibitory effect of combined treatment with crocodile choline and doxorubicin on the proliferation of SMMC-7721 cells组别鳄胆素g/mL阿霉素g/mL抑制率(%)Q值100025012.432.9831003

19、3.404.32415046.246.89500.26.703.07600.412.546.52700.828.727.73801.042.432.57950.214.466.351.391050.425.364.010.621150.827.335.920.731251.032.805.580.6613100.233.952.940.9014100.440.056.040.9615100.849.476.080.9416101.053.473.260.8717150.255.505.491.1118150.467.542.361.2719150.876.574.731.2420151.080

20、.812.961.17鳄胆素与阿霉素联合应用对细胞集落形成能力的影响集落形成实验是一种考察肿瘤细胞药物敏感性的长期实验方法，实验周期为两周.首先将细胞接种于60 mm培养皿中，每皿约2000个细胞,药物处理24 h后撤去药物，继续培养两周，最后吉姆萨染色并拍照.实验结果（图1）显示，SMMC-7721细胞对照组形成的克隆密集且较大，鳄胆素单用药组能看到较小的克隆，数量明显比对照组减少，阿霉素单用药组结果相似，联合用药组则几乎看不到克隆从柱状图可以看出，对照组细胞克隆形成率为88%，鳄胆素单用药组的克隆形成率为30.8%，阿霉素单用药组的克隆形成率为28.5%，联合用药组几乎没有克隆形成，各实验

21、组和对照组克隆形成率比较，有极显著性差异图1 鳄胆素与阿霉素单独或联合用药对SMMC-7721细胞克隆形成能力的影响Fig. 1 Effect of crocodile choline with or without doxorubicin on the colony formation of SMMC-7721 cells鳄胆素与阿霉素联合应用对细胞周期分布的影响应用流式细胞仪检测鳄胆素与阿霉素单独或联合应用对SMMC-7721细胞周期分布的影响，采用ModFit LT 3.3软件对细胞周期进行分析实验结果总结于图2、表2从图2可以看出，没有药物处理时，SMMC-7721细胞主要处于G0/G

22、1期；当细胞用鳄胆素和阿霉素单独处理及联合处理时，细胞周期发生显著变化，细胞处于G0/G1期数量逐渐减少，S期细胞数量显著增加，G2/M期细胞数量变化不大由表2可以看出，处理组与对照组相比，鳄胆素作用24 h后，S期细胞数量增加了5.27%；阿霉素作用24 h后，细胞S期数量显著增加，从12.30%增加到55.91%，增加了43.61%,与对照组相比有显著差异；联合用药组作用24 h后细胞也出现了S期阻滞，S期细胞从12%增加到59%，与对照组相比有显著差异图2 鳄胆素与阿霉素单独或联合作用SMMC-7721细胞24 h后对细胞周期分布的影响Fig. 2 FACS analysis of ce

23、ll cycle of SMMC-7721 cells treated with Crocodile choline with or without Doxorubicin for 24 h表2 不同处理组对SMMC-7721细胞周期影响的数据分析Table. 2 Data analysis of cell cycle distribution of SMMC-7721 cells after treated with different groups for 24 hSpecimensG0/G1（%）S（%）G2/M（%）Control82.7712.304.94Crocodile chol

24、ine75.217.577.24Doxorubicin39.7155.914.38Combined Two29.0759.0311.91细胞凋亡的形态学观察SMMC-7721细胞经过鳄胆素与阿霉素单独或联合处理48 h后，Hochest33258染色，在荧光显微镜下观察并拍照，结果如图3所示从图中可以看出，对照组细胞的细胞核完整，边缘清晰整齐，发出弥散均匀的微弱淡蓝色荧光，细胞核未见浓缩致密染色；鳄胆素单独处理组与对照组相比，有部分细胞核出现变形，皱缩，细胞核内呈现出浓致密的颗粒状强蓝色荧光；阿霉素单独处理组与对照组相比，部分细胞核变形，核断裂，出现凋亡小体；联合处理组细胞数量明显减少，绝大多

25、数细胞核出现核固缩，产生凋亡小体，细胞都发出强蓝色荧光，凋亡特征明显以上结果表明，鳄胆素和阿霉素都能诱导SMMC-7721细胞发生凋亡，两者联合应用效果显著高于单药组A: Control; B: Crocodile choline;C: Doxorubicin; D: Cro+Dox.图3 Hoechst 33258染色观察鳄胆素与阿霉素单用或联用后对SMMC-7721细胞的形态学变化（48 h, 200）Fig. 3 Effect of crocodile choline with or without doxorubicin on the morphology changes of SMM

26、C-7721 cells by staining with Hoechst 33258鳄胆素与阿霉素联合作用对Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白表达的影响采用Western blot实验检测SMMC-7721细胞中Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白的表达，实验结果如图4所示从图4可以看出，在内参蛋白-actin含量一致的情况下，与对照组相比，鳄胆素、阿霉素单独作用促凋亡蛋白Bax的表达都有所增加，两药联合组Bax的表达显著增加，与对照组相比有显著差异但是无论鳄胆素、阿霉素单独作用还是联合作用，对抑凋亡蛋白Bcl-2的表达几乎没有影响说明鳄胆素和阿霉素联合作用促进SMMC-7721细胞凋亡是通过上调Ba

27、x蛋白表达来实现，两者联合具有协同效应A: Control; B: Crocodile choline;C: Doxorubicin; D: Cro+Dox图4 鳄胆素与阿霉素单独或联合作用对Bax和Bcl-2蛋白表达情况的影响Fig. 4 Effect on the expression of Bax and Bcl-2 protein in SMMC-7721 cells讨论肝癌作为目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，被称为“癌中之王”近年来，因我国乙肝病毒感染患者数量递增，肝癌的发病率大增，治疗方式仍以手术为主，术后辅助化疗但化疗药物选择性差，对正常细胞也有杀伤作用，往往毒副作用

28、很强多数化疗药物能引起胃肠道不适、脱发、骨髓抑制等，病人不仅要承受病痛的折磨，还要忍受治疗药物所产生的不适，许多患者往往会因为耐受不住化疗药物对机体的毒副作用而放弃治疗因此，寻求新的更有效的肝癌治疗方法和抗肝癌药物组方是现在医药界面临的重要挑战之一阿霉素已经在临床上用于治疗肝癌，但由于其具有心脏毒性，在使用时受到了很大的限制鳄胆素为本实验室从鳄胆汁中提取得到的具有抗肿瘤功效的天然产物，毒性低，并且对肝癌细胞SMMC-7721具有明显的增殖抑制作用本文将不同浓度的鳄胆素与阿霉素联合使用，MTT法测定其对肝癌细胞的增殖抑制作用，并以金氏公式评价不同浓度两药组合的效果，筛选出了一个具有协同作用的抗肝

29、癌组方：15 g/mL鳄胆素和0.4 g/mL阿霉素随后以集落形成实验对该组方进行了验证，结果表明以上浓度的两药具有协同作用与MTT法不同，集落形成实验是一种考察肿瘤细胞药物敏感性的长期实验方法，周期为 14 天，期间经过多个细胞分裂周期；其次药物干预24 h后撤药继续培养，不仅可以看出药物对肿瘤细胞增殖的抑制能力，在一定程度上还可以看出药物处理对细胞恢复能力的影响，而这种恢复能力可能是癌症治疗后复发的动力两组实验均表明该组方能协同抑制肝癌细胞的增殖S期是DNA合成期，细胞做好合成DNA的准备后，由G1期进入S期，随即开始DNA的合成DNA复制完成后，细胞即进入G2期DNA顺利完成复制、S期周

30、期蛋白的正常表达以及周期蛋白-CDK复合物的形成等都是细胞进入G2期所必需的，一旦出现异常，细胞就不可能从S期进入G2期PI单染结果显示肝癌SMMC-7721细胞经两药联合处理后S期的比例明显增多，表明大量的细胞被阻滞在S期这一结果与史卫红 ADDIN EN.CITE 137371373137317 HYPERLINK l _ENREF_7 o , #1373 7等已报道的索拉菲尼与阿霉素联合应用对HepG2细胞周期影响的结果一致联合组方将SMMC-7721细胞阻滞在S期可能与DNA复制以及CDK激酶的活性有关，具体机制需要通过测定相关蛋白的表达量等后续试验探究Hoechst 33258染色结

31、果显示联合组的细胞经历了细胞凋亡的过程细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生发展的关键多种化疗药物均能引起肿瘤细胞的凋亡通过诱导凋亡治疗肿瘤是目前的一个研究热点 ADDIN EN.CITE Jeong2007137481374137417Jeong, Eun GooLee, Sung HakKim, Sung SooAhn, Chang HyeokYoo, Nam JinLee, Sug HyungImmunohistochemical analysis of phospho-BAD protein and mutational analysis of BAD gene in gastric

32、carcinomasAPMISAPMIS976-9811158phospho-BADmutationgastric cancerapoptosis2007Blackwell Publishing Ltd1600-0463/10.1111/j.1600-0463.2007.apm_804.x10.1111/j.1600-0463.2007.apm_804.x HYPERLINK l _ENREF_8 o Jeong, 2007 #1374 8细胞凋亡是多基因控制的程序化过程与细胞凋亡相关的基因包括Bcl-2蛋白家族，P53蛋白质家族等 Western blot实验结果显示，两药联用后，Bcl-2

33、的表达量几乎不变，而Bax的表达量显著上升Bax和Bcl-2同属于Bcl-2蛋白家族，分别具有促进凋亡和抑制凋亡的功能，在细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用 ADDIN EN.CITE Ola2011137991379137917Ola, MohammadShamsulNawaz, MohdAhsan, HaseebRole of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosisMol Cell BiochemMol Cell BiochemMol Cell BiochemMolecular and cellul

34、ar biochemistryMol Cell BiochemMolecular and cellular biochemistry41-583511-2ApoptosisBcl-2BH-3 only proteinsCaspasesMitochondrial proteinsProgrammed cell death20112011/05/01Springer US0300-8177/10.1007/s11010-010-0709-x10.1007/s11010-010-0709-xEnglish HYPERLINK l _ENREF_9 o Ola, 2011 #1379 9两药联用后，高

35、表达的Bax可能与Bcl-2 形成Bax/Bcl-2异二聚体，抵消Bcl-2的抑凋亡作用；或者过量的Bax寡聚化，插入线粒体外膜上，形成Bax离子通道，离子流入线粒体，细胞色素C转移到细胞质中，激活caspase通路，最终引发细胞凋亡从鳄胆汁中分离制得的鳄胆素，属于天然动物提取物，它不同于常见的化疗药物，无毒副作用体外实验显示鳄胆素与阿霉素联用能协同抑制肝癌细胞的增殖，所得的联合组方亦可作为后续动物实验用药剂量的参考本研究表明一定浓度的鳄胆素可增强阿霉素对肿瘤细胞的杀伤作用，从而避免大剂量应用阿霉素引发的毒副作用，达到阿霉素减毒增效的目的这为天然动物提取物与化疗药物的联合抗肝癌提供了新的思路和

36、实践，为临床上肝癌的药物联合治疗提供了理论支持参考文献 ADDIN EN.REFLIST 1 ElSerag HB, Rudolph KL. Hepatocellular Carcinoma: Epidemiology and Molecular Carcinogenesis J.Gastroenterology, 2007, 132 (7): 2557-2576.2 Qian H, Yang Y, Wang X. Curcumin enhanced adriamycin-induced human liver-derived Hepatoma G2 cell death through ac

37、tivation of mitochondria-mediated apoptosis and autophagy J. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 43 (3): 125-131.3 Huynh H, Chow PKH, Soo KC. AZD6244 and doxorubicin induce growth suppression and apoptosis in mouse models of hepatocellular carcinoma J. Molecular Cancer Therapeutics, 2

38、007, 6 (9): 2468-2476.4 Jin C, Li HM, He Y, et al. Combination chemotherapy of doxorubicin and paclitaxel for hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo J. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2010, 136 (2): 267-274.5 Tint G, Dayal B, Batta AK, et al. Biliary bile acids, bile alcohol

39、s, and sterols of Alligator mississippiensis J. Journal of lipid research, 1980, 21 (1): 110-117.6宋巍，沈东炎，康劲翮等. 暹罗鳄胆汁提取物对人胆管癌MZ-ChA-1细胞的抑制作用J.厦门大学学报（自然科学版）2011,50（5）：938-9417史卫红，卞勇华，宋祥和等.索拉菲尼联合阿霉素对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用J.现代生物医学进展.2011,11(24):4845-4848.8 Jeong EG, Lee SH, Kim SS, et al. Immunohistochemical

40、analysis of phospho-BAD protein and mutational analysis of BAD gene in gastric carcinomas J. APMIS, 2007, 115 (8): 976-981.9 Ola M, Nawaz M, Ahsan H. Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis J. Mol Cell Biochem, 2011, 351 (1-2): 41-58.Effect of Crocodile Choline comb

41、ined with Doxorubicin on Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma Cells SMMC-7721DENG Yi-tao1, DING Yu-mei1, Li Hua-liang1, DONG xin2, SHENG Xu-ying2, CHEN Qing-xi1*( School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; GuangZhou TuoLong Biological Technology Co., Ltd., GuangZhou 510801, China)Abstract: In this paper, we studied the effect of crocodile choline with doxorubicin on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 in vitro. SMMC-7721