粗多糖测定方法的比较

1、一）苯酚法测定可溶性糖【实验原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合 成一种橙红色化合物，在10100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且 在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于 甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白 质存在的影响，并且产生的颜色稳定 160min以上。【实验仪器及试剂】.仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸 水纸适量。.试剂：90%苯酚溶液：称取90g苯酚（AR）,加蒸

2、储水10mL溶解，在室温下 可保存数月。9%苯酚溶液：取3mL 90 %苯酚溶液，加蒸储水至30mL,现配现用。（3）浓硫酸（比重1.84）。1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在 80c下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸储水定容至刻度。100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1 %蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶 中，加水定容。【实验步骤】.标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从010分别编号，按表27 1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入 1mL 9 %苯酚溶液，摇匀，再从管 液正面以5 20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色

3、液总体积为8 mL ,在恒温下 放置30min。显色。然后以空白为参比，在 485nm波长下比色测定，以糖含量 为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。.可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取 0.10 - 0.30g,共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL蒸储水，塑料薄膜封 口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲 洗试管及残渣，定容至刻度。.测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸储水1.5mL,同制作标 准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准 线性方程求出糖的

4、量，按下式计算测试样品中糖含量。式中：C 一标准方程求得糖量（ug）a吸取样品液体积（mL）V 提取液量（mL）n 一稀释倍数W一组织重量（g）可溶性糖含量（）=从标准曲线查得糖的量（g） x提取液体积（ml） x稀释倍数/测定用样品液的体积（ml） x样品重量（g） x 106 x 100粗多糖的检验方法1、方法原理粗多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定样品在粗多糖含量。2、主要设备和仪器设备721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）试齐I葡萄糖标准液：精确称取105c干燥恒重的标准葡萄糖0.1000g,置100mL容量瓶中加热蒸储

5、水溶解稀释至刻度，其浓度为1.0mg/mL,用稀释成浓度为0.1mg/mLd的标准工作液。5嘛酚溶液：取苯酚100g,沙浴蒸储，收集180C-182 c溜分，称取此储分5g,用水溶解后，定 容至100mL棕色容量瓶中备用（现用现配）。3、测定步骤最大吸收波长的选择精密吸取0.04mg/mL无水葡萄糖溶1.0 mL ,置10mL具塞试管中，加入蒸储水使体积为 2.0mL,再 加苯酚试液1.0mL,摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取 出后冷却至室温。以蒸储水代替糖溶液如加上法配制空白。用721分光光度计在470-510nm测定吸 光度，测定最大吸收波长

6、为490nm.标准曲线的绘制精密吸收浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准标准工作液 0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL,分别置于10mL具塞试管中，各加蒸储水使体积为 2.0mL,再加苯酚试液1.0mL,摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0 mL摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出后冷却至室温。以蒸储水代替糖溶液如上 法配制空白。用721分光光度计，1cm比色皿，在490nm处测定吸光度，绘制葡萄糖浓度-吸光度 工作曲线。结果浓度在0.010-0.04mg/mL范围内与吸光度呈现性关系。回归方程 Y=7.52X10-3X+1.13 X10-3, Y=0.9997(n=

7、6)。含量测定多糖的提取与精制 取300mL用氟仿多次萃取，以除去蛋白质，加活性炭1%兑色，抽滤，滤液加入95浓醇，使含醇量达80%静置过夜。过滤，残渣用无水乙醇、丙酮、乙醍多次洗涤， 真空干燥，即得粗多糖。供试液的配制 精密称取粗多糖粉末0.2000g,置于50mL容量瓶中，定容，摇匀，即得供试 品溶液。样品含量测定精密度吸取供试品溶液2.0mL,按“标准曲线绘制”项下方法分别测定吸光 度。结果计算：多糖含量(衿=(C- D) /VX100式中：C供试液葡萄糖浓度(mg/mL ;D-代试液的稀释因素；V供试液体积(mL。粗多糖测定方法的研究摘要:应用硫酸-苯酚比色法测食品中的粗多糖的含量而且

8、分别用葡萄糖做标准 品和用葡聚糖做标准品。结果表明前者测的结果稍偏高 ，大约高于4.8 %。此方 法简便快捷，准确度高，重现性好，可适用于各种粗多糖的测定。关健词：枸杞多糖；灵芝多糖；分光光度法；由十个以上单糖通过糖昔键连接而成的碳水化合物称为“多糖”。它一般都是天然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纤维两大类。 活性多糖专指具有某种 特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等。这些多糖具有 复杂的、多方面的生理活性和功能，如：免疫调节功能；抗月中瘤作用；延缓衰老 作用；降血脂、抗血栓作用等功能1-2,因而越来越引起人们的关注。多糖的测定方法目前还没有国家规定的方法，文献报道的

9、方法基本上是苯酚-硫 酸法和慈酮-硫酸法，在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用 葡聚糖(MW500 000),因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。但是根 据国内外大量研究资料表明：香菇、金针菇、云芝、冬草、夏草、灵芝、扶苓、 猪苓中所含的具有增强免疫、抑制月中瘤、镇静、强心、消炎等生理活性的水溶性 多糖均由6(13)或6(16)糖昔键连接葡聚糖构成主链和支链，有的甚至就 是B-葡聚糖，那么用葡萄糖作标准品和用葡聚糖作标准品去测食品中的多糖含 量时是否有差别且差别为多少，本文以枸杞多糖和灵芝多糖来进行上述实验。.材料与方法供试材料枸杞多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含

10、量在40-60 %,其含量由国家 检测部门检测)；灵芝多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60 %,其含量由国家 检测部门检测)；葡聚糖(MW500 000) sigma 公司；试齐1J(1)铜储备液：称取0.3gCuS045H2O,3g宁檬酸钠，力口水溶解并稀释至100ml,混匀，备用。(2)铜试剂溶液：取铜储备液50ml,加水50ml,混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。 临用新配。(3)洗涤剂：取水50ml,加入10ml铜试剂溶液，10ml氢氧化钠溶液，混匀。(4)乙醇溶液(80 %): 20ml水中加入无水乙醇80ml,混匀。(5)氢氧化钠溶液(10 %):称

11、取lOg氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml,加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。(6)硫酸溶液：取10ml浓硫酸加入到80ml左右水中，混匀，冷却后稀释至 100ml。(7)苯酚溶液(5%):取苯酚100g,油浴蒸储，收集180c -182C微分。称取精制苯酚5.0g,加入溶 解并稀释至100ml,混匀，溶液置冰箱中可保存一个月。(8)葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液：精密称取在1050c于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖标准品1.0080g,加水溶解，并 定容至100ml,混匀，置冰箱中保存。此溶液每 ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。(9)葡萄糖/葡聚糖标准使用溶液：吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液2.

12、00ml,置于100ml容量瓶中，加水至刻度， 混匀，置冰箱中保存。仪器752C紫外分光光度计离心机旋转混匀器实验方法葡萄糖标准曲线制备精密吸取葡萄糖标准使用溶液 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,(相当于葡萄糖0, 0.04032 , 0.08064 , 0.12096 , 0.16128 , 0.2016mg)分别置于 25ml 比色管中， 准确补充水至2.0ml ,加入苯酚溶液2.0ml ,在旋转混匀器上混匀，小心加入浓 硫酸10ml,于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度 计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

13、具体结果 见表1。表1葡萄糖标准与浓度的关系 标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线(图 1) 0图1标准回归曲线方程图其回归方程 Y=4.4122X-0.0147,相关系数r=0.9996。葡聚糖标准曲线制备精密吸取葡聚糖标准使用溶液 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,(相当于葡聚糖0, 0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mg)分别置于25ml

14、比色管中，准确补充水至2.0ml , 加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml,于旋转混匀 器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试2。剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表表2葡聚糖标准与浓度的关系标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456以葡聚糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(见图2) 图2标准回归曲线方程图其回归方程 Y=4.635X

15、-0.0145,相关系数r=0.9983。样品的测定样品提取称取混合均匀的含粗多糖样品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中，加水80ml左右, 于沸水浴上加热2h,冷却至室温后补加水至刻度，混匀，过滤，滤液供沉淀多糖。沉淀粗多糖精密取1.5.1项下滤液4.0ml(V2)(作四组平行实验)或液体样品(V2)4.0ml(即被 测多糖就是液体而不是固体样品)置于50ml离心管中，加入无水乙醇16ml,混匀 后，以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃 去上清液，反复3-4次操作。接下来沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混匀后，供沉淀葡聚糖。沉淀葡

16、聚糖精密取1.5.2项溶液2ml(V4)置于20ml离心管中，加入NaOH7取2.0ml,铜试剂 溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷却后以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉 淀用洗涤剂数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复3次操作后，沉淀用硫酸溶液 2.0ml溶解并转移至50ml(V5)容量瓶中，加水稀薄至刻度，混匀。此溶液为样品 测定液。测定精密取1.5.3项的样品测定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中，加入苯酚溶液 2.0ml,在旋转混合器上混匀后，小心加入浓硫酸10.0ml后于旋转混合器上混匀 后，置于水浴中煮沸10min,冷却至室温用分光光度计在 490nm波长处，以

17、试剂空 白为参比，1cm比色皿测定吸光度值，同时做样品空白实验。从葡萄糖/葡聚糖标准曲线上查出葡萄糖/葡聚糖质量，再计算样品中粗多糖含量(见表3)。表3.以葡萄糖计和以葡聚糖计来确定粗多糖含量编号 吸光度样品中枸杞多糖含量（mg/g）样品中灵芝多糖含量（mg/g）枸杞多糖灵芝多糖以葡萄糖计以葡聚糖计以葡萄糖计以葡聚糖计1 0.150 0.146 0.4532 0.145 0.148 0.4403 0.139 0.142 0.4234 0.150 0.151 0.453 TOC o 1-5 h z 0.4310.4230.4030.4170.4290.4080.4020.4130.3940.43

18、10.4370.4162.计算公式X=（W1W2）X V1X W3 W5/MK V2X V4X V6式中：X 样品中粗多糖含量（以葡萄糖/葡聚糖计）,mg/gW1-样品测定液中葡萄糖/葡聚糖质量，mgW2-样品空白液中葡萄糖/葡聚糖质量，mgM样品质量，gV1-样品提取液总体积,mlV2-沉淀粗多糖所用样品提取液体积，mlV3-粗多糖溶液体积，mlV4-沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积，mlV5-样品测定液总体积,mlV6-测定用样品测定溶液体积，ml.稳定性试验样品显色后，每隔一定时间测定吸光度，结果见表4。表4吸光度稳定性试验时间 10min 20min 30min 1h 1.5h 2hA 0

19、.150 0.151 0.148 0.151 0.150 0.147结果表明，该显色反应稳定。.回收率测定（采用加样回收法）吸取多糖样品溶液0.5ml ,分别加入标准葡萄糖溶液 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,分别置于25ml试管中，各加水1ml,加入苯酚溶液2ml,缓缓加浓硫酸10ml于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。结果显示回收率是 93.15-99.7 %。.小结(1)由表3可知，用葡萄糖来做标准品和用葡聚糖做标准品测食品中的粗多糖含 量时，前者测的结果稍偏高，大约高4.8

20、%，但葡聚糖标准品的价格昂贵且在国内 难于买到，故可以用葡萄糖来代替葡聚糖做标准品。(2)食品中分子量10000的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶性单糖和 低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性的从其它高分子物质中沉淀具有葡聚糖结 构的多糖，粗多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物， 与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定样品在粗多糖含量。(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的测定，因为不需要对多糖进行纯化 和脱色处理。洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用 80%乙醇洗净，否则结果会受影响。参考文献：1方积年，多糖的研究现状，药学学报，1

21、986, 21 (12) : 944-9492刘美琴，灵芝多糖的研究进展，微生物学通报， 1998, 25 (3) : 173STUDY ON CONTENT DETERMINATION OF CRUDE POLYSACCHARIDEHu Juwu, Fan Qingsheng xiao xiaonian(Sino-Germen Joint Research Institute,The key Laboratory of Food Science of MOE, Nanchang University , Nanchang 330047 )Abstract:The content of cru

22、de Polysaccharides were determinated by themeansof UV spectrophotometry and using the criterion of Glucose and the criterion of dextran,respectively.The result is showed: the former sresult is higher than the la tter s and the method is simple,rapid .accurate and reproducible and can be used to many

23、 Polysaccharides.Key words:Ganoderma Lucidum Polysaccharide ; Lycium Barbarum Polysaccharide ； UV spectrophotometry ；粗多糖的测定方法.原理分子量大于 10, 000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。.适用范围参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10, 000道尔顿葡聚糖的样品。.仪器分光光度计离心机旋转混匀器恒温水浴

24、锅4.试齐IJ除特殊说明外，实验用水为蒸储水，试剂为分析纯。80%乙醇：800ml无水乙醇加水 200ml。2.5 mol/L NaOH 溶液：100 g NaOH加蒸储水稀释至1 L ,加入固体无水硫酸钠至饱和。铜贮存液：称取 3.0 g CuSO4 5H2O , 30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存 2周。(4)铜应用溶液： 取铜贮存液 50 ml ,加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g ,临用新配。洗涤液：取水 50 ml ,加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH 溶液， 混匀。1.8 mol/L H2SO4 :取100ml浓硫酸用水稀释

25、至1L。20 g/L苯酚溶液：称取 2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml ,混匀备用。(8)葡聚糖标准液：称取 500mg葡聚糖(分子量 500,000D )于称量皿中，105 c 干燥4h至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml ,葡聚糖标准浓度为1.0mg/ml。(9)葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml,用水稀释 10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。.操作方法样品处理样品提取：称取样品15g,加水100ml ,沸水浴加热 2h,冷却至室温，定容至200ml (V1),混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml ( V2 ),置于烧杯中，加热浓缩至10ml ,冷却后，加入无水乙醇 40ml ,将溶液转至离心管中以3000rpm 离心5min ,弃上清液，残渣用 80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml (V3),混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml (V4),加入 2.5mol/L NaOH2.0ml , Cu应用溶液 2.0ml,沸水浴中煮沸 2mim ,冷却后以 3000rpm离心5min ,弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。测定葡聚糖：上述残渣用 2.0mL 1.8mol/LH2SO4