分子克隆的内涵和方式

1、分子克隆的内涵和方式克隆的概念纯系、无性系一种人工诱导的无性繁殖方式DNA克隆目的：建立繁殖目的基因的细胞系含义：建立目的DNA分子繁殖体系的过程三个要素: 目的基因、载体、受体细胞涉及DNA分子体外重组；转化受体细胞分子克隆步骤 DNA分子体外重组 转化 筛选将核酸分子(DNA)插入到可在原核或真核细胞中无性繁殖的载体中，携带外源DNA的载体在宿主细胞内大量复制的过程经过筛选获得单一克隆2.2 克隆载体要能够独立地在宿主细胞中复制载体的功能为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的表达提供条件载体的功能及其特征载体的特征（应具备的条件）具有对受体细胞的可转移性具有与特定受体细胞相适应的复制

2、位点或整合位点长度尽可能小，以提高其载装能力具有多种单一的酶切位点具有合适的选择性标记 载体类型 克隆载体 表达载体 质粒 噬菌体 粘粒 酵母人工染色体 细菌F因子；P因子目的DNA在宿主细胞中复制目的基因在宿主细胞中复制、表达质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。一、质粒载体质粒的基本特性自主复制性携带有自己的复制起始区（ori） 一个控制质粒拷贝数的基因； 能独立

3、于宿主细胞的染色体DNA而自主复制拷贝数少则几个，多则几百个不等，需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生质粒 p15A 10212 pSC101 及其衍生质粒 pSC101 5 ColE1 ColE1 1520 质粒按复制方式可分为两类： 松弛型复制 严谨型复制少于10个拷贝 可扩增性氯霉素扩增：在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大

4、量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。质粒psc101和p15A的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物）可转移性在天然条件下，有些天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内要素：移动基因mob 转移基因tra 转移起始位点bom 内部的转移缺口位点 nic顺式元件 bom 及其内部的转移缺口位点 nic，mob基因、t

5、ra基因都由质粒提供）人工构建的载体质粒多拷贝 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因整合质粒 装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制表达载体 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达实验室常用质粒 pBR322该质粒具有以下优点分子大小4363bp，容易纯化;含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达

6、到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以产生大量的重组pBR322分子。 质粒小、转化率高质粒大、拷贝数低15kb 转化率成为限制因素pBR322该质粒具有以下优点分子大小4363bp含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。 实验室常用质粒 pUC系列载体 puc

7、系列载体包括4个组成部分：来自质粒pBR322的复制起点 氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌-半乳糖苷酶基因(1acz)的启动子及编码-肽链的DNA序列（1acZ基因）1acz基因5端带有一段MCS，但它并不破坏lacZ基因的功能。在特定的受体细胞中可表现 -互补作用，可通过 -互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反Figure 4.10. Map of plasmid vector pUC19. The origin of replication (ori) was derived originally from a ColE1-li

8、ke plasmid, pMB1. The ampicillin resistance gene (ApR) was derived originally from the plasmid RSF 2124 and permits selection for cells containing the vector molecule. A portion of the lacZ gene is included and is expressed to give an amino-terminal fragment of -galactosidase. This is complemented b

9、y a mutant lacZ gene in the host cell: the products of the vector and host cell lacZ sequences, although individually inactive, can associate to form a functional product. The 54 bp polylinker multiple cloning site (capital letters) is inserted into the vector lacZ (lower case letters) component in

10、such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However, cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and absence of -galactosidase activity. 在特定的受体细胞中可表现 -互补作用，可通过 -互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z, 2743bppGEM-4Z, 2746bp

11、在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如 Sp6 和 T7 噬菌体的启动子pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置。作用：体外转录质粒的制备实验室常采用碱法制备质粒碱裂解法将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质 离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质 及核酸酶 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 无DNase的RNase处理残余RNA 二 DNA载体噬菌体是大肠杆菌的噬菌体裂解途径溶原途径噬菌体由外壳蛋白和-DNA组成；

12、-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区，全长。5GGGCGGCGACCTNN NN3 3NN NNCCCGCCGCTGGA5cos 48502 bp cos DNA进入宿主细胞后，粘性末端连接，形成环型分子 ; 噬菌体含基因50个以上，功能相近的聚集成簇Figure 4.12. Map of the genome, showing positions of genes (vertical bars). In replacement vectors, the nonessential region is removed by restrictio

13、n endonuclease digestion, leaving a left arm and a right arm. A foreign DNA fragment can be ligated to the two arms in place of the original stuffer fragment, providing maximal insert sizes of over 20 kb. Genes required for lysogenic function are located in a central segment of the genome.噬菌体通过特殊的生物

14、学方式将其DNA导入宿主细胞吸附： 注入DNA：吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子此时，噬菌体可选择进入：裂解生长状态（lytic growth） 溶源状态（lysogenic state）将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。 大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒

15、（每个细胞）；包装： 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的。包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状分子被包装，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的-DNA分子。包装与DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装范围内的DNA，包装好了的-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。裂解每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解

16、。 Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage protein coat can be performed using a mixed lysate of two mutated lysogens. Normal in vivo packaging of DNA involves first making pre-heads, structures composed of the major capsid protein encoded by gene E. A unit length of DNA is inserted in the pre

17、-head, the unit length being prepared by cleavage at neighboring cos sites. A minor capsid protein D is then inserted in the pre-heads to complete head maturation, and the products of other genes serve as assembly proteins, ensuring joining of the completed tails to the completed heads. A defect in

18、producing protein E, resulting from an amber mutation introduced into gene E (Eam), prevents pre-heads being formed by BHB2688. An amber mutation in gene D (Dam) prevents maturation of the pre-heads, with enclosed DNA, into complete heads. The components of the BHB2688/BHB2690 mixed lysate, however,

19、 complement each others deficiency and provide all the products for correct packaging. Some of the gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells. 噬菌体生活周期的决定噬菌体: 溶原周期；裂解周期 prophage stateLytic statecI激活自身的表达；关闭cro基因的表达；多数基不因表达Cro激活自身的表达;关闭cI基因；多数基因表达In normally

20、growing host cells, the lysogenic state is favored and the genome replicates along with the host chromosomal DNA.cells favors Damage to host a transition to the lytic cycle, enabling the virus to escape the damaged cell and infect new cellsThe decision to enter the lytic cycle or the lysogenic state

21、 is controlled by two regulatory genes, cI and cro. DNA载体载体的应用得益于体外包装系统J基因到N基因之间的DNA序列对噬菌体的生长不是绝对必需的 ，可以缺失或被外源基因取代，P基因与Q基因之间的序列缺失也仍然可以作为噬菌体使用。插入型载体 经改造后的长度为37 kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为（）由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。Insertion vectorsLambda vectors used for making cDNA libraries do not require a large insert capacity (most cDNAs are 300 kb). The resulting recombinants can be transferred with considerable efficien