生物制药工艺学第四的课件

1、一氨基酸类药物的基本知识第一节 氨基酸类药物的基本概念 H2NCHCOOHR-氨基酸表达通式Pr的基本组成单位（构成天然Pr的20种Aa）均为L-氨基酸(RH,NH2,COOH)Gly（RH）除外不同Aa即有共性又有个性具有立体异构现象1第4章氨基酸类药物氨基酸的立体构型（丙氨酸）作为药物使用的主要是天然氨基酸，即L氨基酸D氨基酸主要用于：1）新型抗生素、抗病毒药的中间体 2）食品、化妆品领域 3）生化试剂领域D-苯丙氨酸是HIV蛋白酶抑制药的关键中间体，也是抗肿瘤药（百士欣）和糖尿病治疗药（纳格列那）的原料D-氨基酸构成的二肽或者短肽，它们甜度高，安全，无热量 2第4章氨基酸类药物构成天然蛋

2、白质的20种氨基酸3第4章氨基酸类药物（1）根据氨基酸在pH5.5溶液中带电状况分为 酸性Aa Aa(PI2.8-3.2) 中性Aa(PI6.2-6.8) 碱性Aa Aa(PI9.7-10.7) （2）依R基团差异分为 脂肪族Aa 芳香族Aa 杂环Aa 1、分类（了解）4第4章氨基酸类药物（1）物理通性： 外观：白色结晶性粉末 熔点(及分解点)均200。 溶解度：水中各不相同，有机溶剂中一般较小。 等电点:均为两性电解质，有各自PI。 旋光性:除Gly外 ，均有旋光性。2、性质(熟悉）5第4章氨基酸类药物（2）化学通性： 两性解离及酰化、烷基化、酯化、酰氯化、酰胺化、叠氮化、脱羧及脱氨反应、肽

3、键结合反应及与甲醛和亚硝酸的反应、林海定反应等。 H2NCHCOOHRR CH COO- NH3+R CH COO- NH2+ H+R CH COO- NH3+R CH COOH NH3+ H+6第4章氨基酸类药物（3） 特殊基团反应 酪氨酸的酚羟基可产生米伦反应与福林达尼斯反应； 精氨酸的胍基产生坂口反应； 色氨酸的吲哚基与芳醛产生红色反应；含有酪氨酸的物质或其他酚类化合物与米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液 ）一起加热出现红色反应的现象 酚基将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物的反应 以萘酚和次氯酸处理样品后，精氨酸出现的红色反应 7第4章氨基酸类药物1、氨基酸的营养价值 必

4、需Aa：人及哺乳动物自身不能合成,需由食物供应 包括赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等8种 非必需Aa：必需Aa以外的氨基酸 半必需Aa：胱氨酸及酪氨酸;精氨酸及组氨酸2、氨基酸的药理效应 治疗消化道疾病、肝病、肿瘤等二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用（了解）8第4章氨基酸类药物 1）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物 谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷酰胺铝、甘氨酸、组氨酸盐酸盐 2）治疗肝病的氨基酸及其衍生物 精氨酸盐酸盐、鸟天氨酸、谷氨酸钠、蛋氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、天冬氨酸9第4章氨基酸类药物 3）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物 谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-

5、羟色氨酸、左旋多巴 4）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物 偶氮丝氨酸、氯苯丙氨酸、磷乙天冬氨酸 5）其它氨基酸类药物的临床应用 胱氨酸、半胱氨酸 （抗辐射损伤）10第4章氨基酸类药物 第二节 氨基酸类药物的生产方法1、氨基酸生产现状 2010年我国Aa总产量300万吨,其中谷氨酸200万吨,占世界谷氨酸产量的2/3.产量:谷氨酸蛋氨酸赖氨酸天门冬氨酸苯丙氨酸胱氨酸 (谷氨酸是全球产销量最大的Aa,占80%)2、氨基酸的应用领域（1）调味品及食品添加剂 约占50%（2）动物饲料 约占30%（3）药用、保健品、化妆品及其他 约占20%概述11第4章氨基酸类药物3、氨基酸类药物的生产方法a.天然蛋白质

6、水解法b.发酵法c.酶转化法 d.化学合成法12第4章氨基酸类药物一、水解法（一）基本原理与过程 （了解） 天然蛋白（毛发、血粉、废蚕丝）（1）水解多种氨基酸混合物（2）分离纯化（3）精制 （结晶）药用氨基酸13第4章氨基酸类药物 水解法生产的氨基酸种类 L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。 蛋白质水解方法（熟悉） 酸水解法 碱水解法 酶水解法 14第4章氨基酸类药物1、蛋白质水解方法（熟悉）（1）酸水解法 蛋白质原料610mol/L HCL或8molLH2SO4 水解110120，1224h除酸多种氨基酸混合物水解液 特点分析 优点：水解迅

7、速、彻底，产物均为L-氨基酸，无消旋作用缺点：色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被破坏,有大量废酸产生，污染环境。色氨酸丝氨酸15第4章氨基酸类药物（2）碱水解法 蛋白质原料6mol/L NaOH或4mol/L BaOH 水解100， 6h多种氨基酸混合物 特点分析 优点：水解迅速、彻底，色氨酸不被破坏 缺点：羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用（工业上多不采用）。酪氨酸16第4章氨基酸类药物（3）酶水解法 特点分析 优点：反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不破坏，无消旋作用。 缺点：水解不彻底，产物中除氨基酸外，还较多肽类。 蛋白质原料 蛋白水解酶T，pH氨基酸和小肽工业上很少用该

8、法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。17第4章氨基酸类药物 2、氨基酸分离方法 （掌握）（1）溶解度法 原理：不同氨基酸在水中或其它溶剂中的溶解度差异 例：胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大 18第4章氨基酸类药物（2）特殊试剂沉淀法 原理：某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物 例：亮氨酸能与邻二甲苯4-磺酸形成不溶性盐沉淀组胺酸与HgCL2形成不溶性汞盐沉淀 精氨酸与苯甲醛生成苯亚甲基精氨酸沉淀利用此反应可从混合氨基酸溶液(如猪血粉水解液)中分别分离L-亮氨酸,组氨酸,精氨酸19第4章氨基酸类药物（3）吸附法 原理：吸附剂对不同氨基

9、酸吸附力的差异 例：颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸附力,可从氨基酸混合液中分离上述氨基酸 指表面能发生吸附作用的固体，一般为多孔微粒或多孔膜，具有较大比表面积物理吸附化学吸附离子交换吸附20第4章氨基酸类药物（4）离子交换法 原理：利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异。在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，因此同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同，可实现氨基酸混合物的分组或单一成分分离静电相互作用力差异离子交换树脂通常用于氨基酸等小分子物质的分离离子交换纤维,离子交换葡聚糖,离子交换树脂离子交换树脂上所带的功能基团通常分为强酸性(R

10、-SO3H),弱酸性(-COOH),强碱性(三甲胺基)和弱碱性(伯胺基,仲胺基,叔胺基)21第4章氨基酸类药物(1) 惰性不溶性载体（骨架）(2) 功能基团或活性基团（与骨架相联）(3) 平衡离子或活性离子（与功能基团所带电荷相反的可移动的离子）离子交换剂的结构组成共价结合平衡离子22第4章氨基酸类药物离子交换基本过程Starting conditionsAdsorptions on sample substancesStart of desorptionEnd of desorptionregenerations23第4章氨基酸类药物3、氨基酸的精制方法 a.结晶和重结晶技术; b.结晶与溶

11、解度法相结合的技术。 24第4章氨基酸类药物（1）结晶和重结晶 丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pI为6.0，故丙氨酸可在pH6.0时，用50冷乙醇结晶或重结晶加以精制。25第4章氨基酸类药物（2) 溶解度与结晶技术相结合的方法 在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍 苯丙氨酸粗品(含少量酪氨酸)15倍体积热水调pH4.0溶解脱色过滤滤液浓缩浓缩液95乙醇，4结晶95乙醇 洗涤烘干苯丙氨酸精品除去大部分酪氨酸26第4章氨基酸类药物（二）用水解法生产氨基酸的品种及工艺（了解） L-亮氨酸（L-Leucine，L-leu）的制备（1）结构与性质 来源：玉米麸质及血粉，角甲、棉籽饼和鸡毛。 外

12、观：白色片状结晶27第4章氨基酸类药物 溶解性 25水中溶解度为2.19，乙醇中为0.017; 75水中为3.82，在醋酸中为10.9，不溶于乙醚。 pI为5.98，熔点为293 a2016o（C=0.5-2.0,在5mol/HCL中）a2511o（C=0.5-2.0,在水中） 28第4章氨基酸类药物 （2）工艺路线水解：110-120 回流水解赶酸：减压浓缩至糊状，加水稀释，重复赶酸三次吸附、脱色：颗粒活性炭柱，进样吸附至流出液出现苯丙氨酸为止，去离子水洗至流出液pH4.0为止，穿柱液与洗涤液合并沉淀：特殊试剂沉淀法（邻二甲苯4磺酸）解析：沉淀水洗两次，抽滤，滤饼加去离子水，氨水调pH至6-

13、8，70-80保温搅拌1，冷却，过滤，沉淀再水洗两次29第4章氨基酸类药物二、发酵法 （）基本原理与过程 1、发酵的基本原理 利用微生物细胞中酶的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其它有机物的过程。发酵法是一个从头合成的生物过程，涉及多种酶的参与，其原料主要是碳源、氮源、无机盐和微生物菌种30第4章氨基酸类药物 初生氨基酸 微生物通过固氮、硝酸还原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸(Gly, L-Ala, L-Asp ，L-Glu) 或微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的新氨基酸 (L-Ala, L-Asp ) 次生氨基酸 在微生物作用下，以初生氨基酸为前体

14、转化成的其它氨基酸(此类Aa占大多数）谷丙转氨酶可使Glu氨基转移到丙酮酸上生成LAla谷草转氨酶可使Glu的氨基转移到草酰乙酸上生成LAspL-Asp是L-Lys的前体，LGlu是LPro的前体31第4章氨基酸类药物图1微生物界糖代谢中间产物及氨基酸之间的转化关系32第4章氨基酸类药物2、发酵法的基本过程 基本过程 培养基配制与灭菌处理菌种诱变与选育菌种培养、灭菌及接种发酵产品提取及分离纯化工业发酵培养基中碳源：淀粉水解糖、糖蜜、甘薯粉等氮源一般为硫酸铵、尿素或豆饼水解液Aa生产菌种主要为细菌，其次是酵母菌1)野生型2)诱变菌株3)杂种菌株 4)基因工程菌平板或斜面培养种子培养发酵培养产谷氨

15、酸棒状杆菌,短杆菌产缬氨酸棒状杆菌突变株AS1.586北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合苏氨酸,色氨酸工程菌已工业化33第4章氨基酸类药物 氨基酸发酵方式： 液体通风深层培养法 摇瓶培养发酵罐 种子罐培养菌种筛选34第4章氨基酸类药物（二）发酵法生产的氨基酸品种及工艺 绝大部分氨基酸均可通过发酵法生产 发酵法生产Aa存在的问题： 产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。35第4章氨基酸类药物1、L-异亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制备（1） 结构与性质：外观：菱形叶片状或片状晶体（乙醇中） 溶解性：L-Ile溶于热醋酸，20乙醇中溶解度为0.072，

16、25水中为4.12，75水中为6.08，不溶于乙醚。 36第4章氨基酸类药物（2）工艺路线菌种培养：一级种子培养（斜面摇瓶,30,16h）二级种子培养（接种量3.5，8h)接种：5m3发酵罐,发酵液装量3吨，接种量1，发酵条件：180rpm, 通气量0.2vvm，30-31,60h过滤：发酵液加热至100，维持10min,冷却过滤（1），滤液，调pH3.5，过滤（2）去沉淀纯化：H+732阳离子交换法，滤液流速:树脂量的1.5/min洗涤：用100L去离子水洗脱：用60，0.5mol/氨水3L/min洗脱37第4章氨基酸类药物（3）工艺过程 菌种培养 种子培养基 一级种子培养基（%）：葡萄糖

17、2 尿素 0.3 玉米浆 2.5 豆饼水解液0.1（以干豆饼计） pH6.5。 二级种子培养基：另加菜籽油0.4，其余同一级种子培养基。38第4章氨基酸类药物 一级种子培养：1000ml三角瓶中培养基装量为200ml，接种斜面AS1.998菌种，30培养,16h。 二级种子培养：接种量3.5，培养8h，如此逐级放大培养得足够量菌种。一级种子培养(摇瓶）一级种子罐扩大培养（二级发酵）二级种子罐扩大培养（三级发酵）种子罐接种方式：（1）降压法将茄子瓶接种针插入接种口，降低种子罐压力，菌悬液自动从茄子瓶注入种子罐（2）火焰封口接种法种子罐接种口周围设有沟槽，接种前向其中注入少量酒精，用火点燃，在接种

18、口形成一圈火焰，在火焰圈中将种子液倒入即可二级种子培养（种子罐）39第4章氨基酸类药物 灭菌、发酵 发酵培养液组成（%）: 硫酸铵 4.5 豆饼水解液 0.4，玉米浆 2.0 碳酸钙 4.5 pH7.2，淀粉水解还原糖初糖浓度 11.5。 灭菌：118120，1.1105Pa压力，30min，立即通冰盐水冷却至25。 注意培养基的优化40第4章氨基酸类药物Response surface methodology (RSM)响应面法(Response Surface Methodology, RSM) 是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，也称回归设计。它能有效地结合数学方法和统计分析，

19、以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，定向地优化响应因子 Y = A0 + Ai Xi + AiiXii 2+ AijXiXj 41第4章氨基酸类药物 发酵： 接种量：1，180rpm，3031，通气量：0.2L（minL）, 发酵60h，在2450h之间不断补加尿素至0.6，氨水至0.27。工业发酵罐接种方式：通过装有阀门（隔膜阀或球心阀）的接种管道接种，种子罐压力发酵罐压力0.05MP以上，利用压差将种子液输入发酵罐注意发酵条件的优化42第4章氨基酸类药物 除菌体、酸化 发酵液加热至100并维持10min，冷却过滤滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。等电点沉淀

20、预处理：热沉淀43第4章氨基酸类药物 离子交换、吸附分离 吸附：H十-型732离子交换树脂柱（40100cm）洗涤：水洗洗脱：60、0.5molL氨水，分部收集洗脱液。离子交换树脂柱44第4章氨基酸类药物三、酶转化法 (掌握） （一）基本原理及过程 原理：在特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸（即利用酶或细胞作为催化剂实现化学转化的过程） 过程： 氨基酸前体相应底物固定化酶或细胞Aa反应液分离纯化Aa成品反应器45第4章氨基酸类药物 酶转化法与直接发酵法的异同： 本质相同，都是利用酶催化化学反应 过程不同： 酶转化法为单酶或多酶的高密度转化（反应过程） 发酵为多酶低密度转化（生命过程）4

21、6第4章氨基酸类药物 酶转化法的优点： 工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少。固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可长期反复使用。47第4章氨基酸类药物（二）酶转化法生产的氨基酸品种及工艺 目前酶催化法生产的氨基酸已达10多种： 酶催化的合成法：延胡羧酸+铵盐L-天冬氨酸天冬氨酸酶L-天冬氨酸L-丙氨酸天冬氨酸-脱羧酶L-精氨酸L-瓜氨酸精氨酸脱亚胺酶吲哚+L-丝氨酸L-色氨酸色氨酸合成酶甘氨酸+甲醇L-丝氨酸丝氨酸转羟甲基酶甘氨酸+乙醛L-苏氨酸苏氨酸醛缩酶48第4章氨基酸类药物酶催化的手性拆分法：可拆分的外消旋体Aa: DL-蛋氨酸、DL-缬氨酸、DL-苯丙氨酸

22、、DL-色氨酸、DL-丙氨酸及DL-苏氨酸等拆分用酶:氨基酰化酶49第4章氨基酸类药物1、L-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备（1） 结构与性质 L天冬氨酸（L-Aspartic acid，Asp）的结构与性质 化学名：-氨基丁二酸或氨基琥珀酸外观：纯品为白色菱形叶片状结晶50第4章氨基酸类药物 溶解性：溶于水及盐酸，不溶于乙醇及乙醚。 等电点:2.77，熔点:269271。旋光性：在碱溶液中左旋，在酸性液中为右旋25D = +5.05（C0.52.0，在水中） 25D= +25.4（C0.52.0，在5molL HCl中）。 酸性Aa理化性质51第4章氨基酸类药物 L-丙氨酸（L-Alanine，

23、简称L-Ala）的结构与性质 外观：菱形结晶（水和乙醇）等电点:6.0，中性氨基酸溶解性： 易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮及乙醚。旋光性： 25D =+18（C0.52.0，在水中） 25D=14.6(C0.52.0，在5mol/L HCl中） 52第4章氨基酸类药物（2）L-Asp和L-Ala的酶转化反应 L-AlaL-ASP53第4章氨基酸类药物（3）工艺路线54第4章氨基酸类药物（4）工艺过程 酶的制备天冬氨酸酶的发酵生产菌种：大肠杆菌（Esscherichia coli）AS1.881L-天冬氨酸-脱羧酶的发酵生产菌种：德阿昆哈假单胞菌68变异株上述两种酶为胞内酶 55第4章氨基酸类

24、药物发酵培养液调pH5.045保温1h,室温含天冬氨酸酶的菌体10002000L一级种子发酵法生产天冬氨酸酶的过程：扩培发酵新鲜斜面56第4章氨基酸类药物发酵培养液调pH4.7530保温1h,含L-天冬氨酸-脱羧酶的菌体10002000L一级种子30 8h二级种子30 24hL-天冬氨酸-脱羧酶的发酵生产发酵57第4章氨基酸类药物细胞固定Ecoli（含天冬氨酸酶）的细胞固定 12明胶， 1戊二醛 含L-天冬氨酸-脱羧酶假单胞菌的固定化 45 5角叉菜胶，戊二醛, 58第4章氨基酸类药物 生物反应堆的制备 生物反应堆1：将含天冬氨酸酶的固定化Ecoli装填于填充床式反应器（40200cm ）.

25、生物反应堆2：将含L-天冬氨酸-脱羧酶固定化假单胞菌装填于耐受1.515105Pa压力的填充床式反应器（30180cm）填充床反应器59第4章氨基酸类药物转化反应 延胡索酸铵底物溶液(37 pH8.5)生物反应堆1转化液L-Asp转化率95磷酸吡哆醛pH6.037 生物反应堆2转化率95连续流 转化液L-Ala分离天冬氨酸酶L-天冬氨酸-脱羧酶60第4章氨基酸类药物 产品纯化与精制 L-Asp转化液滤液过滤调pH2.85结晶过夜过滤结晶冷水洗涤抽干105干燥L-Asp粗品稀氨水溶解活性炭脱色滤液过滤5结晶过夜过滤结晶真空干燥药用L-Asp L-Ala的纯化与精制略61第4章氨基酸类药物（5）作

26、用与用途 用于治疗慢性肝炎、肝硬化及高血氨症。同时L-Asp和L-Ala都是复合氨基酸输液的原料。 62第4章氨基酸类药物2.酶拆分法制备L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-phe） （1）结构与性质 必需氨基酸外观:白色叶片状晶体，无臭，微苦pI为5.48；溶解性：在25水中溶解度为2.96，在75水中为6.62，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。旋光性：25D-4.47(在5mol/L HCl中）25D-34.5（在水中）63第4章氨基酸类药物（2）酶拆分DL-Phe的原理（a-d）：掌握* a. 乙酰化DL-Phe +醋酸酐乙酰-DL-Phe（Ac-DL-Phe） b. 立体选

27、择性水解氨基酰化酶可专一性水解Ac-L-Phe的酰胺键生成L-Phe，而不水解Ac-D-Phe的酰胺键 Ac-L-Phe64第4章氨基酸类药物c. 分离利用L-Phe与Ac-D-Phe在水中溶解度的差异进行分离。 d. 劣对映体的消旋化及再水解Ac-D-Phe可经消旋化生成Ac-DL-Phe，再行水解和分离，如此反复进行，可将DL-Phe全部转化为L-Phe。65第4章氨基酸类药物（3）工艺路线 66第4章氨基酸类药物（4）工艺过程 固定化氨基酰化酶的制备 载体：DEAE-Sephadex A-50 酶的固定化： 酶液按比例与载体混合搅拌吸附过滤洗涤固定化酶67第4章氨基酸类药物 Ac-DL-

28、Phe的制备 DL-Phe冰醋酸醋酸酐171，wvv90，45h浓缩浓缩液冷却、结晶60真空干燥AcDLPhe乙酰化反应反应液68第4章氨基酸类药物 酶水解 1000L反应罐水解反应700L 0.1mol/LAc-DL-Phe钠盐溶液6mol/LHCl搅拌下滴加1520kg固定化氨基酰化酶50pH6.77.045h过滤滤液待分离LPhe69第4章氨基酸类药物 分离纯化 转化后滤液6mol/L HCl调pH至4.8-5.1减压浓缩35L浓缩液结晶过滤洗涤10L冷乙醇抽干烘干LPhe粗品滤液洗涤液AC-D-Phe803-4h0浓缩70第4章氨基酸类药物 精制 LPhe粗品溶解活性炭脱色趁热过滤滤液

29、结晶滤取结晶冷乙醇洗涤干燥 LPhe晶体重结晶药用L- PheAcDPhe的消旋化 纯化及精制后母液浓缩醋酸酐酰化浓盐酸调pH 结晶 AcDLPhe 71第4章氨基酸类药物（5）作用与用途 a. L-Phe为复合氨基注射液的重要原料之一 b.合成苯丙氨酸氮芥及对氟苯丙氨酸等抗癌药的原料。72第4章氨基酸类药物四、化学合成法 （一）基本原理与过程 原料:-卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐等反应过程：氨解、水解、缩合、取代及氢化还原等化学反应 73第4章氨基酸类药物 化学合成法的分类 一般合成法：卤代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法等；产物均为DL-型氨基酸混合物。 不对称合成法：直接合成、-酮酸反应及不对称催化加氢等方法。产物为L-