糖化酶活力测定

1、实验三糖化酶活力的测定指导老师： 孙运军研 究 生： 赵 渊 徐 妙1一、目的和内容 目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法内容：. 学习糖化酶活力的原理. 测定并计算糖化酶活力2二、糖化酶简介以及其活性的测定原理 糖化酶的应用及生产 糖化酶的催化原理 酶活测定方法3 糖化酶的应用与生产糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3），又名淀粉葡萄糖苷（Amyloglucosidase）或-淀粉酶（-amylase），是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在601000kDa 之间。因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶

2、。4糖化酶在工业生产中的应用： 糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发酵。 糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制取，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂之一。5目前，工业中广泛使用黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米根霉(Rhizopus oryzae)和臭曲霉(Aspergillus foetidus)为生产菌株来发酵生产糖化酶。今天的实验用酶就是利用

3、黑曲霉变异菌株进行液体深层通风发酵后提取获得。6糖化酶的作用机制 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖单元，并像- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。还原端7 酶活测定方法测

4、定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰爱农法（法） 、Schoorl法（法）和对硝基苯酚葡萄糖法（法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是46, 温度范围是4060）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解，糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。8次碘酸钠法： 碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出未参与反应的NaIO ，由此

5、推导出糖化酶催化所产生的C6H12O6 的含量。 1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI9注释： 在这一系列的反应中，1m

6、ol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。10对照组实验组11三、试剂与器材1.糖化酶试剂；2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平；3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。12四、操作步骤1. 取7个

7、带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 水浴中预热10min。2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40 ，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。133.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意:加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇

8、匀后在暗处放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）；145.计算：(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：酶活力单位（U/ml）=（BA）（N/2） 180.1（8/5）2（60/10） 式中: B空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）； N硫代硫酸钠的当量浓度。 180.1葡萄糖的摩尔质量。 8/5表示从8m

9、l酶反应体系取出5ml反应液。幻灯片 12 2所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。 60/10表示酶反应时间为10min，按定义为1h。15（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液水解生成1mol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）：酶活力单位（U/ml）=（BA）10-3 （N/2）（8/5）1062 （1/10）式中符号与前式相同，其中： 10-3 ml换算成L。 106 mol换算成mol。16五、实验报告 将重复3次测定的糖化酶活力结果记录在实验报告中，并按提供的两种计算公式分别计算出酶活力。六、问题和思考1. 糖化酶的作用有何特点？2. 你认为实验过程中哪些步骤关键

10、，应注意些什么问题？3. 为什么用失活酶液作为空白对照而不用蒸馏水？4. 两个计算糖化酶活力的公式中各项的意义及两者各有何特点？17七、注意事项1. 注意操作安全;2. 滴定操作时要仔细和准确。糖化酶水解可溶性粉溶液与滴定后至蓝色消失的溶液两者色泽的对比。3. 实验完成以后及时清扫整理；4. 认真完成实验报告 。18 （1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。 （4）0.1mo1/L氢氧化钠溶液 称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 （5）2mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。 （ 6）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O) 24.82g和碳酸钠约