DNA的生物合成课件

1、 第十章DNA 的生物合成 中 心 法 则复制 转录 翻译DNA RNA 蛋白质 逆转录 RNA 复制 遗传信息的传递途径第一节 半保留复制Messelson 与 Stahl 的实验以15NH4Cl为氮源培养细菌若干代，则亲代 DNA 链为重链。换用14NH4Cl为氮源培养细菌，则新生的子代 DNA 为轻链。真核生物细胞可利用氨甲蝶呤抑制从头合成，同时以 5-溴尿嘧啶标记。利用 CsCl 密度梯度离心，可以鉴定 DNA 分子的密度。 DNA 重链与 DNA 轻链子一代与子二代 DNA 的密度半保留复制的生物学意义第二节 DNA 复制的酶学DNA复制的基本条件：核苷酸单体：dNTP遗传信息的指导

2、：模板 DNA酶与蛋白因子：DNA 聚合酶 解螺旋酶引物酶 拓扑异构酶连接酶 单链结合蛋白参与 DNA 复制蛋白的分析方法纯化：分离在逻辑上与复制有关的蛋白质。重建：在体外利用纯化蛋白进行组合，重建 复制过程。突变：利用遗传突变体作为工具，通过各种 突变型的功能缺失，确定特定基因在 活体的功能。 温度敏感突变型：许可温度 33 非许可温度 41一、复制的化学反应反应：(dNTP)ndNTP (dNTP)n1Ppi特点：需要引物与模板，有方向性。二、 DNA 聚合酶DNA-dependent DNA polymerase，DDDP.1958 年，Kornberg 首先自大肠杆菌纯化了 DNA 聚

3、合酶 I。在具有模板、底物与引物的条件下，可以在体外催化 DNA 新链的合成。目前在细菌中发现了 5 类 DNA 聚合酶，在真核细胞中也发现了 5 类 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶 I需要模板 (ssDNA) 与引物 (DNA/RNA)。具有 3 种基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校读作用。5， 3，外切活性：切除 RNA 引物。DNA 聚合酶 I 的校读作用DNA pol I 聚合活性远高于 3， 5，外切活性。发生错配时聚合活性降低，外切活性起作用。错误参入率约 105，校读后为 1010。DNA 聚合酶 I 的结构109 kDa 单一多肽链，在枯草杆菌蛋白酶

4、作用下可被裂解为大片段与小片段。大片段具有聚合与校读活性，称 Klenow 片段。DNA 聚合酶 I 的作用DNA pol I 不是 DNA 复制中起主要作用的酶。延伸速度较慢：20 nt/sec。持续合成能力约 200 bp。大肠杆菌基因组 DNA 长度为 4106 bp，以 pol I 完成复制需一天时间。大肠杆菌 20 min 分裂一代，完成复制只需 40 min。DNA 聚合酶 I 的作用生理功能：DNA 损伤修复；在复制过程中起辅助作用。突变株(只有正常活性的 1)不致死，只是对紫外线敏感。5， 3，外切活性缺陷则致死。每个大肠杆菌约含有几百个 pol I，含量相对稳定，不受细胞生长

5、状态的影响。DNA 聚合酶 II具有 2 种基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校读作用。延伸速度慢，只有 5 nt/sec，持续合成能力约 1500 bp，不适应于复制。突变型大肠杆菌能够正常生长。功能不明，推测可能与 SOS 修复有关。DNA 聚合酶 III具有 2 种基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校读作用。延伸速度快，可达 1000 nt/sec，适用于复制。聚合酶 III 在细胞内数目较少 (20)，且只在细胞生长期间出现，因此最后发现。是 DNA 复制主要的酶。温度敏感突变型是致死突变。DNA 聚合酶 III 的结构核心酶：聚合活

6、性：校读活性：参与亚基组建：结合模板并滑动。 复合物：引导亚基与 模板的结合。10 种亚基组成的多聚体蛋白，每种亚基 2 个，分子量约 140 kDa。3 种 DNA 聚合酶的比较DNA 聚合酶 IV 和 VDNA pol IV 和 V 是在 1999 年才发现的，涉及倾向错误的复制机制。当 DNA遭受严重损伤时可诱导两种酶的生成，完成损伤处的 DNA 复制。因无完整的模板指导，复制缺乏准确性。真核生物 DNA 聚合酶真核细胞的线粒体 DNA线粒体具有自身的遗传物质。线粒体基因组与细菌相似，为环状双链。人类线粒体 DNA 编码 37 个基因。13 个基因编码 ATP 合成相关蛋白，24 个编码

7、 tRNA。线粒体 DNA 随线粒体的分裂而复制，代谢方式于细菌类似。有观点认为：真核细胞是古细菌在厌氧细胞中寄生后产生的。三、解链相关蛋白：解螺旋酶模板 DNA 必须是单链，因此 DNA 复制时必须解链。解螺旋酶：helicase，水解 ATP 提供能量解开 DNA 双螺旋。在大肠杆菌中目前已经发现不少于 10 种解螺旋酶。1976 年第一个解螺旋酶被发现，称为 helicase I。它参与了 F 因子的复制(滚环复制的方式)。参与复制的主要解螺旋酶是 dnaB 基因产物，可以表示为 DnaB。解螺旋酶的种类解螺旋酶有六聚体与二聚体两类。解螺旋酶结合 DNA 单链，有方向性。可分为 53 与

8、 35 两种方向。解螺旋酶 DnaBDnaB ，又称复制型 DNA 解螺旋酶，6 亚基同聚体。其突变型 DNA复制缺陷。 聚合物成为环状，结合于 DNA 单链，53 方向滑动解开 DNA 双链。 功能：与 DnaA、DnaC 相互作用，参与复制起始。与 DnaG 协同，形成引发体合成引物。与 DNA pol III 结合，参与复制全过程。三、解链相关蛋白：单链结合蛋白Single strand binding protein，SSB。同源四聚体，可结合单链 DNA，并且具有协同效应。作用：防止单链回复其双螺旋状态。保护单链不被损伤因素破坏。突变型致死，说明是复制所必需。三、解链相关蛋白：拓扑异

9、构酶改变 DNA 双链盘绕的圈数，解决拓扑学限制。原核生物环状 DNA 分子盘绕圈数无法改变。真核生物线状 DNA 分子极长，也不能改变。大肠杆菌 DNA 复制时其 DNA 每秒旋转 100 次。拓扑异构酶：topoisomerase，即能水解又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶的种类拓扑异构酶 I：产生瞬间单链断裂，催化负超螺旋的松弛。在细菌称蛋白，突变型不致死，非复制必需。突变导致负超螺旋增加，影响转录活性。拓扑异构酶 II：产生瞬间双链断裂，在无 ATP 时松弛超螺旋，在有 ATP 时可引入负超螺旋。在细菌称旋转酶 (gyrase)，结构形式为A2B2。复制必需。是新生霉素、抗萘啶酮酸等抗生素

10、的作用靶。拓扑异构酶 I 的作用机理拓扑异构酶 II 的作用机理拓扑异构酶 II 的作用机理作用：引入或解开超螺旋。松解连环。四、引物酶与引发体DNA 聚合酶需要引物，生理条件下以 RNA 作为引物，而 DNA 不可能成为引物。引物由引物酶 (primase) 合成，dnaG 基因的产物是引物酶。引物酶是 RNA 聚合酶，可从头开始模板链互补链的合成。引物酶与 DnaB 及 DnaC 蛋白形成引发体而发挥作用。BCG53模板链 RNA 引物 (5 nt)Primasome Dna B (helicase) Dna C (bind DnaB) Dna G (primase)OH35引发体：pri

11、mosomeDNA 连接酶Ligase，连接 DNA 双链的单链切口，此反应需要能量。大肠杆菌 DNA 连接酶利用 NAD提供能量。 OH P3 55 35 3连接酶DNA 连接酶作用机理第三节 DNA 复制的过程在真核生物，DNA复制发生于 S 期。一、复制的起始复制是否具有固定位点？是单一位点还是多位点？同时向两个方向进行还是单向进行？需要哪些蛋白的参与？过程如何？原核生物的复制起始点同位素标记，放射自显影，电镜观察，可见复制期间的 DNA 呈状。复制起点是单一的。真核生物的复制起始点真核生物为多复制起点。依据复制速度推断： 人类基因组 6109 bp，单一起点需 3 天。事实上完成 S

12、期只需要 68 小时。电镜观察可见多复制起点。由一个复制起点引导复制的区域是一个复制子。哺乳动物的复制子大约在 100200 kb 之间。双向复制右图：对细菌进行一段时间的低放射性标记后进行短时间强放射性标记，然后放射自显影。下图：果蝇 DNA，短暂强放射性后弱放射性标记。原核生物具有固定复制起始点细菌生长同步化后同位素标记新生 DNA。用已知位点基因序列进行杂交检测。复制有单一固定起点，双向复制。复 制 叉两条 DNA 单链的复制是不对称的。一条链连续合成，为前导链 (leading)。另一条链不连续合成，为随从链 (lagging)。冈崎片段随从链上新生的不连续片段称冈崎片段。因冈崎首先发

13、现而得名。大肠杆菌复制起始点的结构跨度 245 bp，包含 3 个正向重复与 2 对反向重复。13 bp 正向重复：GATCTCTTATTAG，富含 AT， 易于解链。 9 bp 反向重复：TGTGGATTATTATACACA DnaA 蛋白结合部位。大肠杆菌复制起始过程大肠杆菌复制起始过程 起始复合物 起始后 1 分钟的状态原核生物复制起始的调控Col E1 质粒的复制时，由 RNA II 作为引物。RNA I 可干扰 RNA II 的作用，Pop 蛋白则可促进 RNA I 与 RNA II 的结合，均能够抑制质粒复制。Rop 基因突变可以使质粒的拷贝数大幅度增加。原核生物复制起始的调控在大

14、肠杆菌复制起点含有 11 个 GATC 回文序列，可被甲基化酶甲基化。半甲基化的新链不能复制，相比与其它部位的甲基化(1.5min)，起始点甲基化需 13 min。原核生物复制起始的调控半甲基化 OriC 可与膜结合，而全甲基化状态不能结合。与膜的结合对 DNA 在分裂时的分配非常重要。真核生物复制起始与调控在酵母细胞，复制起点称为自主复制序列，autonomously replicating sequences，ARS。ARS 序列长度约 150 bp，其中含有 11 个碱基的保守序列，是 ORC 复合体结合的部位。起点识别复合物，origin recognition complex在一条酵

15、母染色体可能有多个 ARS，酵母的 17 条染色体共有 400 个 ARS。在高等动物细胞中还没有发现这样的起始序列，起始区域有较大的随机性。真核生物复制起始与调控在 G1 期，Cdc6p 结合于 ORC。Cdc6p 的结合促进 MCM 复合体的形成。当酵母细胞进入 S 期后，两种蛋白激酶激活转录。CDK-cyclin BCdc7p-Dbf4p二、复制的延伸前导链与后随链的合成在延伸过程中，前导链与后随链的合成平行进行。DNA 聚合酶 III 的不对称性是其结构基础。冈崎片段间的连接滚环复制一些单链 DNA噬菌体 或 F 因子的复制方式。在 F 因子复制时，单链产物穿过细菌间结合性菌毛进行传递

16、。滚环复制真核生物的延伸过程复制的主要酶是 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶的作用是合成引物。PCNA，增殖细胞核抗原。功能类似于原核聚合酶 III 的亚基。RFC，类似原核聚合酶 III 的复合物。RPA，单链结合蛋白。真核生物核小体的复制在真核生物，DNA 复制时核小体结构必需首先解离。在复制完成后，新生的 DNA 链迅速与组蛋白结合，重新形成核小体。真核生物核小体的复制同位素标记新生核小体，通过交联剂交联，分析后发现，核小体的重新组装是半保留的。核小体发生了解离和重新组装。三、复制的终止原核生物具有复制终止点复制终止于起始点的对侧，但不是自发终止。具有两个复制终止区，分别作用于两个复制叉。

17、终止区包含 23 bp 的保守序列，只能单向起作用。Tus 蛋白结合并终止复制。线状 DNA 复制的末端问题线状 DNA 复制时末端将产生小范围缺失。这段缺失区域称为 primer gap。如果不能修复，则 DNA 将随复制的代数而逐步缩短。端 粒 telomere真核细胞染色体末端的特殊结构，由 DNA 及端粒结合蛋白组成。作用：保证染色体结构的稳定。解决末端问题。结构：短序列重复多次而成。 人类：TTAGGG，515 kb。端 粒 酶 telomerase细胞中存在端粒酶，可延长端粒。端粒酶作用于 DNA 的 3，末端，延长端粒的重复单位。其互补链区域可完成一次新的后随链合成。端粒酶的作用

18、机理端粒酶由酶蛋白及 RNA 组成。端粒延长的爬行模型：利用自身 RNA 模板指导合成 DNA。酶蛋白具有逆转录酶活性。端粒是细胞寿命的决定因素 体外培养细胞具有固定的传代次数，超过一定代数细胞将停止分裂并死亡。端粒的长度是细胞寿命的限制因素。端粒的长度随细胞的分裂而缩短。老龄鼠来源的细胞端粒较幼龄鼠来源的细胞端粒短，分裂代数也少。分化的体细胞端粒较短，胚胎细胞与干细胞端粒较长。端粒酶是细胞分裂能力的基础 没有端粒酶活性的细胞不能无限分裂。具有端粒酶的细胞有无限分裂的潜能。胚胎期细胞以及干细胞等端粒酶活性较强。肿瘤细胞端粒酶活性增强。有可能是肿瘤细胞获得无限增殖能力的原因之一。第四节 DNA

19、损伤与修复DNA损伤损伤因素正确修复突变细胞死亡一、DNA 损伤内在或外在因素造成的 DNA 结构的破坏。内在因素：自发损伤，如 C 脱氨为 U。 正常代谢物造成的损伤，如 O2。外在因素：物理因素：紫外线 化学因素：烷化剂 亚硝酸 碱基类似物 羟胺类物质紫外线造成的损伤紫外线导致嘧啶二聚体的形成。有 T-T；T-C；C-C 三种形式。其他类型的电磁波或粒子束也可造成损伤。亚硝酸盐造成的损伤亚硝酸造成 A 或 C 脱氨。AH，H 与 C 配对。CU，U 与 A 配对。C 常发生自发脱氨，发生率 8/hr/cell。DNA 含有 T 而无 U 具有重要意义。烷化剂造成的损伤1942 年，英国人最

20、早发现军用毒气氮芥可造成严重的 DNA 损伤。烷化剂可造成碱基的烷基化，导致碱基脱离或诱发突变。二、DNA 损伤修复修复的前提：信息的完整：DNA 双链只损伤一条链。需要能量：ATP 或 光能。修复的方式：原位的恢复。损伤部位的切除与再合成。对损伤的耐受。1. 光修复细菌紫外线照射避光死亡细菌紫外线照射可见光照射存活率上升光修复酶：黄素蛋白，可吸收 370 nm 可见光，直接分解嘧啶二聚体。光修复是自然界最古老的一种 DNA 修复方式。在细菌中普遍存在。在植物中也发挥重要作用在高等动物中作用有限，哺乳动物不具备光修复酶。2. 切除修复切除损伤部位并合成新生 DNA 链以替代之。DNA 双链中只

21、有一条受损时可修复。切除修复是自然界分布最广，也是最重要的一种修复方式。方式：ABC 内切酶参与的核苷酸切除修复。糖苷酶与 Ap 内切酶参与的碱基切除修复。细菌的核苷酸切除修复ABC 内切酶在损伤处两侧产生切口，去除 1213 nt 片段。DNA pol I 与 ligase 完成填补。人类的切除修复缺陷：着色性干皮病Xeroderma pigmentosum, XP患者皮肤对紫外线敏感，易患皮肤癌。共发现了 9 种基因与此病有关。机制：解螺旋酶解链 两种内切酶酶切 pol /填补碱基切除修复尿嘧啶糖苷酶，嘧啶二聚体糖苷酶等可切除碱基，产生无嘌呤无嘧啶位点 (Ap 位点)。Ap 内切酶在 Ap

22、 位点 5，端产生切口。DNA pol I 完成切除与填补。3. 重组修复损伤部位复制时无法生成互补链，产生大范围缺失。recA 基因编码重组蛋白。recA细菌对紫外线敏感。本身并不能修复损伤，只是一种对损伤的耐受机制，保证遗传信息的完整。损伤可在下一轮复制前被修复。损伤可被无限稀释。4. SOS 修复在细菌 DNA 损伤严重时激发的一种倾向差错的修复机制。双链同时受损，遗传信息丢失。细菌中存在特异性较差的复制系统，正常情况下其基因不活跃，被 Lex A 蛋白所抑制。RecA 蛋白具有蛋白酶活性，可被 DNA 损伤激活。RecA 酶解 Lex A，从而激活 SOS 修复。LexA 蛋白的作用倾向差错的复制体系LexA 的分解导致多种基因的活化：激活切除修复机制，如 uvrB 基因。激活特异性低的复制体系。DNA pol IV 与 V：DNA Pol III 在复制时受阻，可被 IV 或 V 所替换。RecA可直接酶解并激活 DNA pol V：UmuD2UmuC UmuD，2UmuC三、突 变DNA 碱基序列的异常改变。突变发生的原因：复制中的错误参入。DNA 损伤的异常修复或未能修复。突变的种类：错配缺失与插入重排DNA 链上碱