细胞培养1细胞结构、成分和培养技术

1、细胞培养1细胞结构、成分和培养技术一、细胞的基本结构（一）概念：细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。一般认为：1 细胞是由膜包围的原生质（Protoplasm）团，通过质膜与周围环境进行物质和信息交流。2 细胞是构成有机体的基本单位，具有自我复制的功能，是有机体生长发育的基础。3 细胞是代谢与功能的基本单位，具有一套完整的代谢和调节体系。4 细胞是遗传的基本单位，具有发育的全能性 。 （二） 细胞结构-总览 细胞是现代生物体最基本的结构单位。DNA中储存着细胞结构和作用信息，细胞有一套完善的机制来建构自身、发挥功能，从而维持自身活性，其中包括产生两个子细胞的细胞分裂（有丝分裂）作用； 是包

2、裹着核仁的双层膜结构，上面有很多复杂封闭结构的气孔。核膜也与内质网相连。内质网 是膜物质，是蛋白质合成场所。 粗糙内质网上覆盖着核糖体，粗糙内质网中生成的蛋白质被运输到平滑内质网,平滑内质网上无核糖体。内质网是膜物质。内质网中生成的蛋白质被运输到平滑内质网,平滑内质网上没有核糖体。中心体是微管的起源，微管构成细胞骨架为细胞制造能量，线粒体中含有酶，参与制造高能量分子，（如，ATP，三磷酸腺苷）ATP是细胞中常见的能源物质，例如，ATP提供能源物质给马达蛋白主要是一层脂质双分子膜，包围细胞，使之与外界隔绝。同时，细胞膜也包含很多通道，物质交换在这里发生。细胞膜也包含连接结构，将相邻细胞紧密连接起

3、来Golgi body transforms and packs proteins and other substances produced in the ER.核仁 包含着用DNA（脱氧核糖核酸）记录的细胞结构功能信息。（三）动物、植物细胞的结构 二、细胞的化学成分 组成细胞的基本元素是：O、C、H、N、Si、K、Ca、P、Mg，其中O、C、H、N四种元素占90%以上。细胞的化学元素可分为两大类：无机物和有机物。在无机物中，水是最主要的成分，约占细胞物质总含量的75%-80%。二、细胞的化学成分1 水与无机盐水是原生质最基础的物质。无机盐。2 细胞的有机分子蛋白质核酸糖类脂类3 酶与生物催

4、化剂酶RNA催化剂三、细胞培养基本概念 细胞培养是指从体内取出组织摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其基本结构和功能的一种培养技术，细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。细胞体外培养的三个层次：组织培养（Tissue Culture）细胞培养（Cell Culture）器官培养（organ Culture）以上三个层次的培养，又可统称为体外培养（In Vitro）.体外培养包括：细胞培养、组织培养、器官培养。 四、动物细胞培养方法1 静止培养： 应用细胞管、多孔板、罗氏瓶等；培养时静止不动。注意以下几点:培养量一般不要超过总体记得1/3，液体厚度不要

5、超过1cm.若用普通温箱培养，必须盖紧盖子或塞紧橡皮塞。若用CO2培养箱培养，则不要盖紧瓶塞，并将CO2浓度控制在5%。一般2d换一次液，细胞长成单层要及时分种传代。四、动物细胞培养方法2 施转培养 应用转瓶，并放置在转床上培养。为了增加培养细胞面积，可以在转瓶内加入多层同心圈。3 悬浮培养 它适应于一切能在悬浮条件下生长增殖的细胞，即贴附依赖性细胞。用于该类细胞培养的设备结构基本与培养细菌的相同，用于细胞培养的称为生物反应器。四、动物细胞培养方法4 微载体培养 它适于一切贴附依赖性细胞，即贴壁细胞的培养，用葡聚糖制成微粒，即微载体培养贴壁细胞的新技术。5 微载体在低速搅拌时就可以悬浮。6 微

6、载体培养的传代和扩大培养。7 微载体的再生利用。 为了降低载体的消耗，有些类型的微载体还可以再生利用。四、动物细胞培养方法8 巨载体和微囊培养 将细胞包埋在凝胶体或微囊内，也叫包埋体。由于有的凝胶载体制备的较大，直径在23mm，因此又称为巨载体培养。9 多孔微球培养 它把微载体和巨载体两者优点结合在一起，细胞既可附着在载体表面，又可以渗入载体较大的孔隙而生长在在体内。四、动物细胞培养方法10 中空纤维培养 该培养器模拟机体的毛细血管系统，有数百至数千根中空纤维集束组成。该纤维的材料为聚砜丙烯聚物，纤维壁厚5075um,成多孔性。内层有超滤膜，内腔用以灌流充以氧气的培养，外腔用以培养细胞。11

7、灌流培养 过滤培养法，它的特点是在培养过程中，不断的灌流补充新的培养基，同时不断地排出已消耗的培养基及细胞代谢过程中新生的有害物质，这样就可以大大的培养密度，提高细胞的产量。五、细胞培养的环境1 无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件，当细胞放置在体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力。一但被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染，代谢物及时消除等是维持细胞生存的基本条件。2 恒定的温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定的适宜温度。人体细胞培养的标准温度36.50.5,偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚

8、至死亡。五、细胞培养的环境3 气体环境 气体是细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需要的各种成分，如三大营养素：蛋白质、糖类、脂类。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数的细胞的适宜PH值是7.27.4。五、细胞培养的环境4 细胞培养基 培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖、增值的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类：（1） 合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、

9、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。五、细胞培养的环境无机盐 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4对调解细胞渗透压、某些酸的活性及溶质的酸碱度都是必要的。氨基酸 颉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸，它们都是细胞用以合成蛋白质的必然原料。维生素 维生素是维持细胞的一种生物活性物质，在细胞中大多数形成酸的辅基或辅酶，对细胞的代谢有重大影响。碳水化合物 碳水化合物使细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分，几乎所有的培养基都以葡萄糖作为必含的能源物质。细胞培养的环境（2）天然培养基

10、使用的最普遍的天然培养基是血清，如小牛血清，血清中含有多种细胞生长因子，促贴附因子及其多活性物质，与合成培养基合用。5 细胞培养设施和基本条件实验室环境，如净化条件。常用实施及设备。培养器皿等。六、培养细胞形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能附在支持物上生长特征，可分为贴附性生长和悬浮性生长两大类。1 成纤维型细胞 在培养中的细胞及形态与成纤维细胞类似时，皆可称为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名。细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央与卵圆形核，胞质向外伸出23厘米。六、培养细胞形态2 上皮细胞 此类型细胞在培养器皿支持物上生长，具有扁平不规则多角形

11、特征，细胞中央有圆形核，细胞紧密相连，单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞，如皮肤，表皮衍生物，消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮形态生长。3 游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则，如羊水细胞培养的早期。 七、营养液配制1.HanKS液10倍浓缩液：甲液 NaCl 80g, KCl 4g, CaCl21.4g, MgSO4 2g.乙液 Na2HPO4 1.52g, KH2PO4 0.6g, 葡萄糖10g, 1%酚红溶液16ml.甲乙液按顺序分别溶于注射用水450ml中，然后将乙液加入甲液，补足水至1000ml，过

12、滤后加入氯仿2ml，置28保存，使用时作10倍稀释。11615分钟，使用前7.5%NaHCO3调PH值7.27.4。七、营养液配制2 营养液 0.5%乳汉液， 水解乳蛋白 5g， HanKS液 1000 ml， 完全溶解后分装，经116 15分钟，28保存备用。使用时为7.5%NaHCO3溶液，将PH值调到7.27.4。 3 3%谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 3 g， 注射用水 100 ml， 溶解后，滤过除菌，-20保存，使用时100 ml细胞营养液加3%谷氨酰胺溶液1 ml。七、营养液配制4 细胞分散液： 0.25%胰蛋白酶溶液 NaCl 8g, KCl 0.2g, 枸橼酸钠 1.12 g，

13、 磷酸二氢钠 0.056 g， 碳酸氢钠 1 g， 葡萄糖 1 g， 胰蛋白酶（1：250）2.5g， 注射用水加至1000 ml。放28，待胰蛋白酶完全溶解后，用0.2um的微孔滤膜或G6型玻璃器滤过除菌。分装小瓶中，-20保存。5 7.5%NaHCO3溶液 碳酸氢钠7.5 g， 注射用水100 ml。 用微孔或蔡氏滤器滤过除菌，分装小瓶，冻结保存。6双抗液 八、清洁液配制1 稀配方：重铬酸钾100 g，加纯化水750 ml，加温溶化，冷却后缓缓加入浓硫酸250 ml。2 浓配方：重铬酸钾79 g，加纯化水100 ml，加温溶化，冷却后缓缓加入浓硫酸1000 ml。3 注意：配制消毒液时，浓硫酸必须缓缓加入，若注入过快，易产生大量的热反应，危险。九、细胞制备工艺 取10日龄SPF鸡胚无菌手术取出鸡胚 用 HanKS液洗3遍 去头到入小烧杯剪碎 用HanKS液洗3遍 将剪碎的组织倒入0.25%胰酶液中 37消化40分钟（或置入28冰箱过夜） 倒掉胰酶液 加玻璃珠分散细胞 加入营养液 分装到培养瓶内（