5电泳质粒-紫外测DNA

1、第一步，先把天然胰岛素拆成A、B两条链， 再把它们重新合成为胰岛素；第二步，用人工合成的链同天然的A链相连接；第三步，把人工合成的链与人工合成的B链相结合。 前排右起：陆德培、邢其毅、施溥涛，后排右起：季爱雪、李崇熙、叶蕴华、汤卡罗 电泳：重组质粒的酶切鉴定紫外分光光度法检测DNA含量实验五质粒DNA电泳的上样安排：同组的未切的质粒混合液和组内各人的酶切后的质粒相邻上样9l 酶切产物+3l loading buffer8-9l 质粒+3l loading buffer基因工程诞生的技术突破 限制性内切酶（restriction enzymes）1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性

2、核酸内切酶。 Werner Arber 理论预见限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶来源：原核生物功能：自我保护细菌的限制和修饰系统（R/M体系） pUC119图谱重组质粒BamH IHind III双酶切电泳检测5-G G A T C C-33-C C T A G G-5BamH I5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III电

3、泳结果：M：Marker1：酶切样品12：酶切样品23：酶切样品34：未酶切质粒M3211Kb200bp100bp2Kb5Kb600bp400bp4酶切结果紫外分光光度法检测DNA分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。分光光度技术752型分光光度计特点 灵敏度高：测定下限可达105106mol/L, 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差25 （12）操作简便快速应用广泛 吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外 远红外（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm

4、780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m氢灯 复合光(阳光及钨灯)发射光谱红 橙 黄 绿 青 蓝 紫单色光三棱镜可见光分光光度计光源紫外分光光度计光源有关光学原理吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯(254nm)甲苯(262nm)A230 250 270 DNA的吸收峰光吸收基本定律: Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760) A=lg(I0/It)=k1b比尔定律(18

5、52)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介质厚度(cm)Lambert-Beer定律 A或DK C L 吸光度 摩尔消光系数 吸收物质的光径（cm） 溶液浓度（mol/L） dsDNA=50(OD260) 稀释倍数（单位为g /ml） 分光光度计的基本部件1. 光源分光光度计上常用的光源有两种： 近紫外光区 可见光区 钨丝灯 近红外光 紫外光区氢灯、氘灯 光电2. 单色器单色器是把混合光波分解为单一波长光的装置。 棱镜光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，折射率与波长成负相关。 衍射光栅在石英或玻璃的表面刻划许多平行线，通过光的干涉和衍射，形成光谱。入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光

6、红紫12800 600 500400吸收池（或称比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃或石英制成注意：a. 与光束垂直；b. 规格相同；c. 清洁5. 检测器光电，并逐级放大6. 测量装置电流表、记录器和数字示值读数单元 吸光度与浓度的关系 A = bc 吸光度光源检测器 吸光度光源检测器b 吸光度光源检测器b0.000.220.42确定空白对照，调试紫外分光光度计“调0，调100”以待测样品的“溶剂”作为空白对照，在波长260nm处调节紫外分光光度计读数至“0”确定稀释倍数：取待测的DNA溶液，加入比色杯，读取260nm 的吸收值若度数不在0-1之间，则需进行相应比例的稀释（用蒸馏水或TE），并记录稀释倍数实验操作（调试分光光度计，确定DNA样品的稀释倍数）确定待测DNA的260nm 的吸收值。 260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度：OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA公式： dsDNA=50(OD260) 稀释倍数 （单位为g /ml）测定280nm的吸收值。 按相同方法测定280nm的吸收