亚麻籽日粮抑制炎性基因表达

1、彭健 占志平 黄飞若 罗杰 戴晋军 晏向华 华中农业大学动物营养与饲料科学系湖北 武汉 430070 Huazhong Agricultural University亚麻籽日粮抑制炎性基因表达、提高猪日增重及肌肉重的调控机制研究1内容提要一、问题的提出二、材料与方法三、结果与分析四、讨论五、结论六、致谢21、炎性细胞因子与动物免疫和生长的关系在现代规模化和集约化畜牧生产中，动物经常面临的各种病原和非病原的免疫刺激在免疫应激条件下，炎性细胞因子IL-1、IL-6和TNF- 分泌大量增加 (鼠:Yang和Cook, 2003; 禽: Takahashi等, 2002; Guo等, 2004; 猪:

2、 Balaji等, 2000; Chartrand等,2003; 赖长华等，2005） 一、问题的提出3IL-1、IL-6和TNF-具有显著的行为、神经内分泌和代谢效应，细胞因子的过量产生会导致严重的生长抑制(Simopoulos et al., 2002) - 食欲减退（ Spurlock, 1997) - 骨骼肌蛋白质降解增加 ( Mitchell et al., 2001) - 肝脏急性期蛋白（acute-phase protein， ACP)合成增加（Johnson ,1997） - 骨骼肌蛋白质合成减少一、问题的提出4图 1 炎性细胞因子改变生长激素轴影响动物生长和蛋白质沉积（Thi

3、ssen等, 2007） IL-1IL-6TNF-生长激素/胰岛素样生长因子轴GH/IGF轴）抑制机体生长和导致肌肉蛋白质降解5在抗原刺激下细胞因子的过量产生，使日粮本来用于骨骼肌生长的营养物质转而用于支持免疫系统的代谢反应 一、问题的提出免疫应激条件下促炎细胞因子分泌增多是导致动物生长受阻的重要原因 !（Spurlock，1997；赖长华等，2005)6 2、n-3PUFA对炎性细胞因子分泌的调控作用十年以前已经发现n-3PUFA对免疫系统的调控作用 - n-3PUFA抑制炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF-的产生 （Calder，2003） - n-3PUFA抑制IFN-、IL-2、I

4、L-8、IL-12 的产生（Narayanan et al.，2003; Fan et al.，2004; Mayer et al.，2003; Fritsche.，2000） 一、问题的提出72、 n-3PUFA对炎性细胞因子分泌的调控作用（续）日粮中加入n-3 PUFA能减少免疫或炎症模型条件下炎性细胞因子的产生，缓解对动物的生长抑制 (Korver et al.,1997; Xi et al., 2001; Gaines et al., 2003) 一、问题的提出83、 n-3PUFA对炎性细胞因子分泌的调控机制n-3 PUFA可能通过直接作用于胞间信号通路，导致激活一种或多种转录因子而

5、发挥作用（Calder, 2002; Pascual et al., 2005） 超氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors-，PPAR） 激活PPAR-能抑制IL-1、IL-6和TNF-基因的表达(Pascual et al., 2005) 一、问题的提出9n-3 PUFA上调PPAR啮齿类动物猪敏感性低Ding et al., 2000; Hsu et al., 2004靶器官中n-3PUFA必须达到有效的富集浓度才能发挥调控基因转录的作用（ Hsu et al., 2004）一、问题的提出104、 亚麻籽（flax,

6、 Linum usitatissimum）的成分特点油ALA(C18:3n-3) （USDA, 1986; Matthews et al., 2000）1/31/26%不会改善生长性能Kouba et al., 2003短期添加15%亚麻籽（25 d）不会产生负面效应Romans et al, 1995 a, 1995b本试验亚麻籽的添加量为10%，并选用含生氰糖甙低的完全成熟的油用亚麻籽作为日粮中n-3 PUFA来源一、问题的提出11假 设 通过在正常生产条件下猪生长肥育期日粮中等量添加n-3 PUFA，但添加的持续时间不同（0d，30 d，60d和90d），使靶器官中的n-3PUFA达到不

7、同的富集量 脾脏、肌肉组织和脂肪组织中的PPAR 炎性细胞因子基因的表达 减少骨骼肌蛋白质降解，提高肌肉中蛋白质的合成，改善猪的生产性能121、试验动物与日粮：24头 80d 4d 长大（长白大约克）健康去势公猪，按体重随机分成4个处理组，每组6个重复栏，单栏饲养，试验为期90 d 二、材料与方法13 生长期 (3060kg)肥育期 (60115kg)对照日粮亚麻籽日粮对照日粮亚麻籽日粮成分 (%)玉米48.7060.5052.9065三等粉18.00麦麸20.001.00豆粕27.0026.5021.0021.00脂肪粉 3.303.10亚麻籽10.0010.00预混料 3.003.003.

8、003.00营养含量粗蛋白（%）18.0718.0116.0516.08粗脂肪（%）5.595.875.566.02钙（%）0.690.660.650.70总磷（%）0.500.510.490.55消化能（Mcal/kg）3.423.413.403.40有效磷（%）0.3180.3310.2510.310赖氨酸（%）1.0731.0460.9260.94710.0010.003.303.10亚麻籽脂肪粉表1 日粮营养成分（%）粗蛋白18.0718.0116.0516.08粗脂肪5.595.875.566.02对照组日粮亚麻籽日粮对照组日粮亚麻籽日粮14生长期 (3060kg)肥育期 (6011

9、5kg)对照日粮亚麻籽日粮对照日粮亚麻籽日粮C12:00.090.000.100.00C14:01.090.111.100.11C15:00.080.000.080.00C16:069.5011.4069.6010.54C16:10.100.380.110.39C18:04.004.764.094.25C18:1n-9c11.7324.8110.7424.18C18:2n-6c12.4924.1711.9625.90C20:00.190.210.180.21C20:10.060.060.040.23C18:3n-30.9730.341.0832.59C22:00.040.120.050.11C

10、22:6n-30.030.390.090.20n-612.4924.1711.9625.90n-31.0030.731.1732.79SFA74.9916.6075.2015.22PUFA13.4954.9013.1358.69n-6/n-312.490.7910.220.79P/S0.183.310.173.8669.5069.6030.3432.59C16:0C18:3表2 日粮脂肪酸组成11.4010.540.971.08对照组日粮亚麻籽日粮对照组日粮亚麻籽日粮152、试验设计采用完全随机设计，4个处理组分别在屠宰前0 d（T1组），30 d（T2组），60 d（T3组）和90 d（T4

11、组）饲喂含10%亚麻籽的日粮，而其他时间饲喂对照日粮。处理效应为亚麻籽添加时间3、饲养管理试验期间猪在半封闭生长肥育猪舍单栏饲养，每日早上8点、下午4点各投料一次，自由采食和饮水。其它管理及免疫均按猪场常规程序进行 C (n=6)T1 (n=6)T2 (n=6)T3 (n=6) 80-110d110-140d140-170d对照日粮亚麻籽日粮二、材料与方法164、数据处理处理-效应分析：亚麻籽添加时间（处理）和ADG、 肌肉重及炎性相关基因表达量的线性及二次曲线关系用REG过程进行分析 ADG和肌肉重与炎性相关基因表达量之间的非线性关系用NLIN过程分析，迭代方法为GAUSS-NEWTON法

12、对PPAR和炎性相关基因表达量进行相关分析 数据用最小二乘均值表示（显著水平为 P 0.05）17表3 亚麻籽添加时间对猪生长性能的影响项目宰前亚麻籽添加时间，天 0 (T1)30 (T2)60 (T3)90 (T4)SEMP1ADFI, g2,0402,0282,0652,16026.04NSADG, g6627257536578.16Q*G:F, g/kg3263583663233.50Q* *P 0.05. 1NS = 不显著；Q= 亚麻籽添加时间的二次效应。三、结果与分析18表4 亚麻籽添加时间对猪肌肉重的影响（kg）项目宰前亚麻籽添加时间（d）0 (T1)30 (T2)60 (T3)

13、90 (T4)SEM P1背最长肌2.462.652.682.950.061L*股二头肌1.481.511.541.330.082NS股四头肌1.101.181.221.240.021L*瓣膜肌 0.950.930.951.030.063NS腰肌 0.480.450.510.450.032NS半腱肌 0.380.420.450.450.011L*股薄肌 0.200.240.240.250.024NS *P 0.05. 1NS = 不显著；Q= 亚麻籽添加时间的二次效应。193、亚麻籽添加时间对猪各种组织基因表达的影响表5 亚麻籽添加时间对PPAR基因表达的影响基因 来源宰前亚麻籽添加时间，天0

14、 (T1)30 (T2)60 (T3)90 (T4)SEMP2脾脏1.4531.751.992.100.023L*PPAR肌肉0.871.311.541.490.021L*脂肪1.571.772.071.970.054NS20表6 亚麻籽添加时间对组织中IL-1基因表达的影响*P 0.01.1IL-1= 白细胞介素-1。2L 和Q 分别表示亚麻籽添加时间的显著的线性和二次效应。 3半定量RT-PCR数值以特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值。基因 来源宰前亚麻籽添加时间，天0 (T1)30 (T2)60 (T3)90 (T4)SEMP2脾脏2.7431.050.830.6

15、20.026Q*IL-1肌肉1.891.740.991.120.013L*脂肪2.791.650.720.790.029Q*21表7 亚麻籽添加时间对组织中IL-6基因表达的影响*P 0.01.1IL-6 =白细胞介素-6。2L表示亚麻籽添加时间的显著的线性效应。 3半定量RT-PCR数值以特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值。基因1来源宰前亚麻籽添加时间，天0 (T1)30 (T2)60 (T3)90 (T4)SEMP2脾脏2.0531.801.301.210.022L*IL-6肌肉1.831.611.481.330.018L*脂肪1.851.701.301.180.0

16、17L*22表8 亚麻籽添加时间对组织中TNF-基因表达的影响*P 0.01.1TNF- = 肿瘤坏死因子-。2L表示亚麻籽添加时间的显著的线性效应。3半定量RT-PCR数值以特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值。基因1来源宰前亚麻籽添加时间，天0 (T1)30 (T2)60 (T3)90 (T4)SEMP2脾脏1.9531.631.461.310.032L*TNF-肌肉1.271.170.910.790.013L*脂肪1.921.731.351.330.044L*234、PPAR和炎性细胞因子表达量的相关分析表9 脾脏中PPAR与炎性细胞因子表达量的相关分析基因 PPA

17、RIL-1IL-6TNF-PPAR1.00IL-1-0.731.00(.0001)IL-6-0.700.791.00(0.0002)(.0001)TNF-0.770.750.731.00(.0001)(.0001)(.0001)24表10 肌肉组织中PPAR与促炎细胞因子表达量的相关分析基因 PPARIL-1IL-6TNF-PPAR1.00IL-1-0.751.00(.0001)IL-6-0.630.691.00(0.0012)(0.0003)TNF-0.700.820.761.00(0.0002)(.0001)(.0001)25表11 脂肪组织中PPAR与促炎细胞因子表达量的相关分析基因1P

18、PARIL-1IL-6TNF-PPAR1.00IL-1-0.541.00(0.0074)IL-6-0.300.831.00(0.17)(.0001)TNF-0.320.620.611.000(0.1380)(0.0017)(0.0020)26小结 1 1、 PPAR与IL-1、IL-6 和TNF-的mRNA丰度在肌肉组织（R2 = 0.63，P 0.01）和脾脏（R2 = 0.69，P 0.001）中呈显著的负相关（P0.01) 2、在脂肪组织中PPAR与IL-1和TNF-的mRNA丰度呈显著的负相关（P0.01) 27表 12 亚麻籽添加时间对血清中炎性细胞因子浓度的影响（pg/mL）项目宰

19、前亚麻籽添加时间，天 0 (T1)30 (T2)60 (T3)90 (T4)SEMP2IL-134.124.124.154.080.131NSIL-60.610.040.300.010.232NSTNF-73.2567.9754.3151.894.143L*P 0.01.1NS = 不显著；L = 亚麻籽添加时间的显著的线性效应。2使用对数转换标准化数据。5、血清中促炎细胞因子浓度28小结 2 - 随亚麻籽添加时间的延长，血清中TNF-的浓度线性降低 - 血清中IL-1和IL-6的浓度未呈现规律性变化296. 肌肉组织中PPAR的表达量与ADG的关系亚麻籽添加时间分别为宰前1（），30（），6

20、0（）和90 d（）。X轴上的数值为特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值。30亚麻籽添加时间分别为宰前1（），30（），60（）和90 d（）。X轴上的数值为特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值。7、脾脏中TNF-的表达量与ADG的关系31 小结3 1、ADG随肌肉组织中PPAR的表达量的增加而呈二次曲线改善 - 在本试验条件下，添加亚麻籽60 d，猪的ADG相对其它处理组更高 ；添加时间不足或延长可能对ADG产生不利影响。2、 ADG随脾脏中TNF-的表达量 降低而呈二次曲线改善 328、肌肉组织中PPAR 的表达量与背最长肌重的关系亚麻籽添加时间

21、分别为宰前1（），30（），60（）和90 d（）。X轴上的数值为特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值 33亚麻籽添加时间分别为宰前1（），30（），60（）和90 d（） X轴上的数值为特定基因在线性扩增循环数内的信号除以-actin信号的比值。9、肌肉中TNF-的表达量与背最长肌重的关系34小结 41、背最长肌重量随肌肉组织中PPAR的表达量的升高而呈二次线性增加 2、 背最长肌重量随肌肉组织中TNF-的表达量的降低而二次线性增加 35随着亚麻籽添加时间的增加，ADG（P 0.05）和G:F呈（P 0.01）二次曲线上升 背最长肌、股四头肌和半腱肌重随亚麻籽添加时间增

22、加呈线性增加（P 0.01） 1、在屠宰前一定时间（60d）内持续添加亚麻籽促进了生长肥育猪肌肉的生长和发育， 改善了生长性能 四、讨论 362、日粮中添加10%亚麻籽的促生长效果不是因为补充了缺乏的ALA引起的本研究发现各处理组在试验结束时背最长肌，皮下脂肪和肝脏中均含有适度的ALA -各处理组背最长肌，皮下脂肪和肝脏中ALA在总脂肪酸中的含量分别大于0.5%，0.9%和2.1%（刘则学，2006） - 与Nguyen等2003年报道的结论一致 四、讨论 37四、讨论 3、猪日粮中添加亚麻籽对生长性能的改善作用可能与调节炎性细胞因子的产生有关- 外源添加小剂量的IL-1、IL-6或TNF-，

23、能降低啮齿类动物体外培养肝细胞或肌细胞中IGF-I的mRNA表达量而抑制GH作用的发挥（Thissen et al., 1997; Frost et al., 2003）。断奶仔猪的免疫应激模型也发现，LPS刺激后2 h血浆中TNF-浓度极显著上升（P 0.01），同时伴随血浆中IGF-I的浓度降低（P 0.05）和GH抵抗（Wright et al., 2000）。 这些结果表明：在免疫应激时，n-3 PUFA能降低促炎细胞因子的产生，可能会促进GH/IGF轴作用的发挥，从而改善动物的生长性能（Korver and Klasing, 1997; Xi et al., 2001） 38四、讨论

24、 3、猪日粮中添加亚麻籽对生长性能的改善作用可能与调节炎性细胞因子的产生有关（续） - 日粮中持续添加亚麻籽抑制了组织中炎性基因的表达和血清中TNF-的浓度- 这表明在正常生产/生理条件下，日粮中n-3 PUFA抑制了生长肥育猪促炎细胞因子的表达39四、讨论 3、猪日粮中添加亚麻籽对生长性能的改善作用可能与调节炎性细胞因子的产生有关（续）- 回归分析发现脾脏中TNF-的mRNA丰度与ADG之间显著的二次曲线关系；肌肉中TNF-的mRNA丰度与背最长肌之间存在显著的二次曲线关系40四、讨论 在炎症状态下，动物血清中TNF-的水平高达2.86.0 ng/ml，从而导致骨骼肌蛋白质发生降解，骨骼肌重

25、损失(Vreugdenhil et al., 1992; Nakashima et al., 1995)- 本试验中，随着饲喂亚麻籽日粮的时间延长，猪血清中TNF-的水平从0.073 ng/ml （0d）降低到了0.052 ng/ml （60d） 这意味着炎性细胞因子的适度表达有利于猪生长性能的发挥414、PPAR在介导日粮中n-3 PUFA促生长效果中的作用n-3 PUFA脾脏(线性)增加肌肉组织(二次曲线)上升PPARDing et al., 1999, 2000未检出肌肉中PPARGH/IGF轴STAT5促炎细胞因子Olsen and Haldosn, 2006; Jiang et al., 2007GLUT4Meadus et al., 2002四、讨论 -PPAR通过不同的途径对动物生长性能的影响也被本研究的回归分析结果部分地证实42五、结 论日粮中n-3 PUFA在相同的添加水平下，可以通过添加时间的延长达到有效的富集量，下调炎性基因的表达，并改善生长性能 n-3 PUFA的促生长效应可能与一种依赖于PPAR的机制有关，这种机制使