载体构建操作流程

1、载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个 质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环 DNA和线性DNA。超螺旋结构应至少占到90%。测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒EEnzyme I1pLEnzyme II1pL10 xX Buffer2pL火菌水to 20|iL总体积20pL将上述体系置于37C （不

2、同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2叫进行电泳检测。3、回收质粒凝胶回收参照 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。1）称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1H进行计向胶 块中加入胶块融化液Buffer GM,我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一 般加入3个凝胶体积量。2）均匀混合后室温15-25C融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约510分钟）。3）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的溶液转

3、移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。4）将 700 H 的 Buffer WB 加入 Spin Column 中，室温 12,000 rpm 离心 30 秒钟， 弃滤液。5）重复操作步骤。6）将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，室温 12,000 rpm 离心 1 分钟。7）将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入30 H的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。8）将灭菌蒸馏水或El

4、ution Buffer加热至60C使用时有利于提高洗脱效率。9）室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。4、检测取1叫凝胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小与目的大小是否一致。用核酸定量仪测回收片段的浓度。二、插入片段准备1、两端带有酶切位点的PCR产物如果设计的扩增目的片段的引物带有酶切位点及相应的保护碱基，可以采用限制 酶进行双酶切，具体参考质粒双酶切的体系及鉴定方法。2、寡核苷酸（包括shRNA和linker）如果要构建shRNA载体，那么需要合成shRNA上下游寡核苷酸引物。引物回来之后，首先根据说明书上提供的信息，用水溶解到终浓度为1g/lo引物退火试剂体积F2R2H2

5、。46在PCR仪上进行引物退火，退火体系设置为90C 3min, 37C 1hr。结束之后马上进行连接，或者冻到-20C保存。三、连接我们实验室采用的是 Fermentas T4 DNA Ligase EL0014 kit1、粘性末端连接按照下面体系进行加样ComponentAmountLinear vector DNA20-100 ngInsert DNAmolar ratio over vector (1:1 to 5:1)10X T4 DNA Ligase Buffer2plT4 DNA Ligase (5 u/pl)1 u (0.2pl)Water, nuclease-freeto 2

6、0 plTotal volume20 pl在PCR仪中22C孵育10min,可根据片段大小适当调整连接时间。取5pl连接产物进行转化50叫感受态细胞，剩下的保存备用。2、钝性末端连接按照下面体系进行加样ComponentAmountLinear vector DNA20-100 ngInsert DNAmolar ratio over vector （1:1 to 5:1）10X T4 DNA Ligase Buffer 2plT4 DNA Ligase (5 u/pl)5 u (1pl)50% PEG 4000 Solution2plWater, nuclease-freeto 20 plT

7、otal volume20 pl在PCR仪中22C孵育1 hr,可根据片段大小适当调整连接时间取5pl连接产物进行转化，剩下的保存备用。3、载体连接linker按照下面体系进行加样ComponentAmountLinear vector DNA100-500 ng磷酸化的linker1-2 Ug10X T4 DNA Ligase Buffer2plT4 DNA Ligase (5 u/p l)2 u (0.4pl)50% PEG 4000 Solution2plWater, nuclease-freeto 20 plTotal volume20 pl充分混匀，短暂离心后，放在PCR仪中22C孵

8、育1 hr, 65C放置10min使酶失 活。取5pl连接产物进行转化，剩下的保存备用。四、转化按照DH5a说明书进行操作步骤取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100但，可 以根据实际情况分装使用。以下实验以100 m感受态细胞为例。待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA （根据实际情况加 入适量的DNA，通常100但感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。42C热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。向每个离心管中加入900 pl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后 置于37C摇

9、床，150rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。取100 pl已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培 养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37C培养12-16小时。注意：1）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量 转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300 pl转化产物涂布平 板。若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm, 2分钟）后吸除部分培养液， 悬浮菌体后将其涂布于平板中。2）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37C直至液体被吸收后再 倒置培养。3）涂布剩余的菌液可置于4C保存，如果次日的转

10、化菌落数过少，可以将剩下 的菌液再涂布新培养基进行培养。注意事项转化所有步骤均在无菌条件下操作。感受态细胞应在-80C下保存，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受 态细胞的转化效率。包装中有0.1 ng/pl的pUC19DNA，供对照试验使用。一定要使用与质粒载体对应的抗生素。五、挑单克隆一般培养8-9个小时即可看到小的菌落，培养12个小时即可挑单克隆，一般培 养16个小时即可放到4C保存。挑菌1、待平板的菌落长至足够大达到可挑的水平。2、在超净工作台中，在灭菌过的试管内倒入5-10 mL灭过菌的培养基，培养基 根据需要预先加入抗生素（由菌落所携带的质粒上的抗性基因所决定）。注意抗 生素要

11、按比例加入培养基，并要清楚标记，未用完的培养基要及时放回4C冰箱。3、用镊子夹取灭菌的牙签挑取平板上的单菌落，在试管内的培养基中蘸洗几下， 旋紧管盖后再将牙签丢弃于台外的收集箱中。注意挑菌时不提倡将牙签直接投入 培养基中，挑菌时一定要挑清晰正常的单菌落，挑过菌的牙签一定不要留在超净 工作台中。4、挑菌后请将装灭菌牙签的小烧杯封好，并及时清理工作台面。5、接种过菌落的试管在摇床中合适的温度下摇动培养，摇速一般为170230 r/min。 注意试管要在摇床上放好，有适当的倾斜角度（45左右）。不同的菌株和摇菌 目的需要不同的温度和摇速。六、克隆鉴定1、菌液PCR使用普通的PCR体系，每管加入1皿菌液进行PCR。注意事项：引物选择：使用掺入片段的全长引物、定量引物、两端通用引物、通用引物与定 量引物交叉使用。菌落的处理：一般摇4个小时即可进行鉴定。PCR体系：一般用20或251体系，用普通体系即可，如果片段长达大于2000, 可选用TaKaRa LA Taq体系。模板量：一般加菌液