试验酶活测定方法

1、1淀粉酶活性测定原理淀粉酶从淀粉中分解出还原物质，可以从他们与3, 5-二硝基水杨酸的还原反应能力来测 定这些还原物质，以一水麦芽糖计算。一个淀粉酶单位相当于在规定条件下释放lmg还原碳 水化合物(以一水麦芽糖计算)时所需的酶量。主要试剂磷酸盐缓冲液(PH 6.9)；取0.067M的磷酸二氢钾溶液(9.12gKH2PO4溶于蒸馏水中，并定 容至1000ml)与0.067M的二水磷酸氢二钠溶液(11.93gNa2HPO4 -2H20溶于蒸馏水中，并定 容至1000ml)混合，直至用测得其PH值达到6.9为止。取39mg氯化钠溶于35ml上述溶液 内，并用蒸馏水定容至100ml。底物溶液：取1.0

2、g可溶性淀粉溶于100ml上述磷酸盐缓冲液。指示剂溶液：取1.0g 3,5-二硝基水杨酸(C7H4N207)与少许蒸馏水拌和。添加20ml2N氢氧 化钠溶液后此酸便溶解。取30.0g四水酒石酸钾钠(C4H4KNa064H20)溶于此溶液，并用蒸馏 水将此指示剂定容至100ml。(4)麦芽糖溶液；称取l00mg 一水麦芽糖(C/u H20)用蒸馏水定容至l00ml。测定方法用移液管将1.0ml底物溶液移入一试管，并加热至25C。加1.0ml酶溶液(同样也已预热至 25C)，摇匀，保温3min后加2ml指示剂溶液，终止反应。将此溶液置于沸水浴中5min后， 取出来置于冰水中或进行流水冷却。随后用蒸

3、馏水定容至20ml。用分光光度计于490nm处， 以空白值为参比测定其颜色深度。以1ml灭活的酶液作为空白对照。2脂肪酶活性测定原理脂肪酶为一种水解酶，在一定条件下，可以把甘油三酯脂肪逐步水解，最后生成甘油及对 应的脂肪酸。用己知浓度的标准溶液对水解液进行滴定，即可定量求出脂肪酸的量，从而 求出脂肪酶活性。1个脂肪酶单位相当于在试验条件下释放出1mol醋酸所需的量。主要试剂0. 025 molL-1 磷酸缓冲液(PH 7.5)：甲液：称取KH2P0417. 0lg，加水定容到500ml。乙液：称取 Na2HP04 - 12H20 44.7g，加水定容到 500ml。取甲液13ml，乙液lOOm

4、l混合，即成PH 7.5、0. 25 mol-L-1磷酸缓冲液，再稀释10倍 即成PH 7.5、0. 025 mol-L-1磷酸缓冲液。聚乙烯醇橄榄油乳化液：l4%聚乙烯醇液：称取40g聚乙烯醇(聚合度为10001750),加蒸馏水约1000ml，水浴 加热搅拌至溶。冷却后定容至1000ml，双层纱布过滤，备用。最终乳化液：取上述4%聚乙烯醇溶液150ml，加50ml橄榄油，于高速组织捣碎机中搅 动6分钟(分两次进行)，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。0. 05 molL-1氢氧化钠标准溶液：称取40g氢氧化钠加蒸馏水至1000ml，成为约1N的 溶液，经标定浓度后准确稀释到0.05N。1%酚

5、酞指示剂：lg酚酞溶于100m195%乙醇中。测定方法力口 5ml 0.025molL-1(PH7. 5)磷酸缓冲液和4ml聚乙烯醇橄榄油乳化液于三角烧瓶中， 置于40C水浴中预热lOmin。加入酶液lml，40C保温15min，立即加入15ml 95%的乙醇 终止酶的反应。加酚酞指示剂23滴后以0. 05 molL-1氢氧化钠标准溶液滴定到微红色， 记下氢氧化钠溶液的消耗体积。重复二次测定。并以lml灭活酶液代替作为空白对照。3蛋白酶活性测定原理磷钨酸和磷钼酸的混合物(即福林酚试剂)在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝 色化合物(钼蓝和钨蓝混合物)。用蛋白酶催化水解血红蛋白(底物)游

6、离出含酚基的氨基酸， 与福林酚试剂呈蓝色反应，可从蓝色的深浅测定酶活性的大小。在37C，每分钟胃蛋白酶A分解血红蛋白产生的溶于三氯乙酸的物质，与福林酚试剂反应后 在660nm的光吸收值相当于l Ug分子酪氨酸所给出的光吸收值则为1个单位。主要试剂底物溶液(2%血红蛋白)：lg血红蛋白溶于50ml 0.06N盐酸。1N福林酚试剂。0.5N氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4g，用蒸馏水定容至200ml。5%三氯乙酸：5g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水。0.0lN盐酸：取盐酸0.84 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。0.06N盐酸：取盐酸5.04 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。0. 2N盐酸：取盐酸16.8 ml,用蒸馏水定容至1000 ml。酪氨酸标准液：精密称耿干燥到恒重的酪氨酸0.01812 g,用0, 2N盐酸溶解并稀释到100ml,此溶液每ml含酪氨酸1ug分子。测定方法在25C恒温条件下，取3支试管按表8进行测定。表8蛋白酶活性测定步兼空日管W)标准管样品管(n)l)L加入酪赛酸标准液0. 302.加入侍测醒液0,103.加入0.01N盐度0. 500.200.404.在37保温数分钟S.迅速加入底物溶液立耶计时并混匀2. 502, 502. 50&准确反应10分钟，立即加入5%三氮乙酸5.005.005.007用高心或过滤的方法除去沉淀，与取一套试管&取离心后上清液