人类疾病动物模型分类和设计原则

1、人类疾病动物模型分类和设计原则12007-20142014纲要人类疾病动物模型意义及优越性动物模型的设计原则动物模型的分类动物模型的选择遗传工程动物模型基因工程改造动物模型建立方法2PART I人类疾病动物模型3概念意义优越性4人类疾病动物模型 是指医学研究中建立的具有人类疾病表现的动物实验对象和相关材料。 应用动物模型是现代医学认识生命科学客观规律的实验方法和手段。 5意义人类疾病动物模型的研究，本质上是比较医学的应用科学，研究人员可利用各种动物的生物特征和疾病特点与人类疾病进行比较研究。长期以来人们发现，选用人作为实验对象来推动医学的发展是困难的，临床所积累的经验不仅在时间和空间上存在着局

2、限性，许多实验在道义上和方法学上还受到种种限制。动物模型克服了这些不足，其在生物学医学研究中所起到的独特作用，正受到越来越多的重视。6优越性避免了直接人体实验造成的危害临床上直接研究外伤、中毒、肿瘤病因等研究是有困难的。动物可以作为人类的替代者，在人为设计的条件下反复观察和研究。可以克服伦理和社会道德的限制，允许采用某些不能应用于人类的方法途径，可以方便的获取样品。7优越性2. 临床上平时不易见到的疾病可用动物复制出来临床上一些疾病不常见,如放射病、毒气中毒、烈性传染病、外伤、肿瘤等，可以采用实验性诱发的方法在动物身上复制出来。8优越性3.可提供发病率低，潜伏期和病程长的疾病的动物模型9临床上

3、还有一些如遗传性、免疫性、代谢性和内分泌、血液等疾病，发生发展缓慢、潜伏期长，病程也长，可能几年或几十年,在人体很难进行3世代以上的连续观察。人们可有意选用动物种群中发病率高的动物，通过不同手段复制出各种模型，在人为设计的实验条件下反复观察和研究，甚至可进行几十世代的观察，同时也避免了人体实验造成的伤害。优越性4. 可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性10一般疾病多为零散发生,在同一时期内,很难获得一定数量的定性材料,而模型动物不仅在群体数量上容易得到满足，而且可以在方法学上严格控制实验条件，在对饲养条件及遗传、微生物、营养等因素严格控制的情况下，通过物理、化学或生物因素的作用，限制实验

4、的可变因子，并排除研究过程中其它因素的影响，取得条件一致的、数量较大的模型材料，从而提高实验结果的可比性和重复性，使所得到的成果更准确更深入。优越性5.可以简化实验操作，便于样品收集动物模型作为人类疾病的“复制品”,可按研究者的需要随时采集各种样品或分批处死动物收集标本，以了解疾病全过程，这是临床难以办到的。实验动物向小型化的发展趋势更有利于实验者的日常管理和实验操作。11优越性6.有助于更全面地认识疾病的本质在临床上研究疾病的本质难免带有一定局限性。许多病原体除人以外也能引起多种动物的感染，其症状体征表现可能不完全相同。但是通过对人畜共患病的比较，则可以充分认识同一病原体给不同机体带来的各种

5、危害，使研究工作上升到立体的水平来揭示某种疾病的本质。动物模型能够细致观察环境或遗传因素对疾病发生发展的影响，可以全面地认识疾病的本质。12总结因此，一个好的疾病模型应具有以下特点：再现性好，应再现所要研究的人类疾病，动物疾病表现应与人类疾病相似。动物背景资料完整，生命周期满足实验需要。复制率高。专一性好，即一种方法只能复制出一种模型。应该指出，任何一种动物模型都不能全部复制出人类疾病的所有表现，动物毕竟不是人体，模型实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或一个方面与人类疾病相似。所以，模型实验结论的正确性是相对的，最终还必须在人体上得到验证。复制过程中一旦发现与人类疾病不同的现象，必须分析

6、差异的性质和程度，找出异同点，以正确评估。132.设计原则相似性重复性可靠性适用性和可控性易行性和经济性14？15相似性能够找到与人类疾病相同的动物自发性疾病当然最好。例如日本人找到的大白鼠原发性高血压(SHR大鼠)就是研究人类原发性高血压的理想模型，小型猪自发性冠状动脉粥样硬化是研究人类冠心病的理想模型；自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎十分相似，也是一种理想模型，等等。与人类完全相同的动物自发性疾病模型毕竟不可多得，往往需要人工加以复制。为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择。其次，为了尽可能做到模型与人类相似，还要在实践中对方法不断加以改进。如果动物模型与临床情况

7、不相似，在动物身上有效治疗方案就不一定能用于临床，反之亦然。16重复性理想的人类疾病动物模型应该是可重复的，应是可标准化的，不能重复的动物模型是无法进行应用研究的。为了增强动物模型复制时的重复性，必须在动物品种、品系、年龄、性别、体重、健康情况、饲养管理；实验及环境条件，季节、昼夜节律、应激、室温、湿度、气压、消毒灭菌；实验方法步骤；药品生产厂家、批号、纯度规格、给药剂型、剂量、途径、方法；麻醉、镇静、镇痛等用药情况；仪器型号、灵敏度、精确度；实验者操作技术熟练程度等等方面保持一致，因为一致性是重复性的可靠保证。17可靠性复制的动物模型应力求可靠的反映人类疾病，即可特异地可靠地反映该种疾病或某

8、种机能、代谢、结构变化。同时应具备该种疾病的主要症状和体征，并经受一系列检测 (如心电图、临床生理、生化指标检验、病理切片等) 加以证实。若易自发地出现某些相应病变的动物，就不应加以选用，易产生与复制疾病相混淆的疾病者也不宜选用。如：大鼠易患进行性肾病，容易与铅中毒所致的肾病相混淆，不适合复制铅中毒模型。蒙古沙鼠较为适合。18适用性和可控性设计复制人类疾病动物模型，应尽量考虑在今后临床能应和便于控制其疾病的发展，以便于开展研究工作。如：雌激素能中止大小鼠的妊娠，不能中止人的妊娠。含有雌激素活性的避孕药无法使用大小鼠筛选。 有些动物对致病因子特别敏感，易死亡，不好控制不适宜复制动物模型。如犬腹腔

9、注射粪便滤液而引起腹膜炎，犬可很快大量死亡，来不及观察和治疗。19易行性和经济性 复制动物模型设计，应尽量做到方法容易执行和合乎经济原则。小动物如大小鼠、地鼠、豚鼠等也可以复制出十分近似的人类疾病模型。它们容易做到遗传背景明确，体内微生物可加控制，模型性状显著且稳定，年龄、性别、体重等可任意选择，而且价廉易得、便于饲养管理，因此可尽量采用。除非不得已或一些特殊疾病（如痢疾、脊髓灰白质炎等）研究需要外，尽量不用灵长类动物。除了在动物选择上要考虑易行性和经济性原则外，在模型复制的方法上、指标的观察上也都要注意这一原则。3.动物模型的分类按产生原因分类：1、诱发性动物模型2、自发性动物模型3、抗疾病

10、型动物模型4、生物医学动物模型20诱发性动物模型又称为实验性动物模型，是指研究者通过使用物理的、化学的、生物的或复合的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的病变。21优缺点诱发性疾病动物模型具有能在短时间内复制出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要等特点，因而为近代医学研究所常用，特别是药物筛选研究工作所首选。但诱发模型和自然产生的疾病模型在某些方面毕竟存在一定差异。因此在设计诱发性动物模型要尽量克服其不足，发挥其特点。22诱发因素物理因素 ：机械损伤、放射线损伤、气压、手术化学因素 ：化学药致

11、癌、化学毒物中毒、强酸强碱烧伤、某种有机成分的增加或减少导致营养性疾病等。生物因素 ：细菌、病毒、寄生虫、生物毒素等。复合因素 ：应用单一因素诱发难以达到实验的要求时23应用实例24High Fat Diet induced Obesity252627Bone marrow transplantation自发性动物模型指实验动物未经任何人工处置，在自然条件下动物自发产生，或由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物模型。利用这类动物疾病模型来研究人类疾病的最大优点，就是疾病的发生、发展与人类相应的疾病很相似，均是在自然条件下发生的疾病，其应用价值就很高。如自发性高血压大鼠、中国地鼠的自发

12、性糖尿病、肥胖症小鼠等。28应用实例29抗疾病型动物模型是指特定的疾病不会在某种动物身上发生，从而可以用来探讨为何这种动物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳动物均易感染血吸虫病，但居住于洞庭湖流域的东方田鼠却不能复制血吸虫病。生物医学动物模型是指利用健康动物生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病模型。如：沙鼠缺乏完整的基底动脉环，是研究中风的理想动物；兔胸腔的特殊结构30按系统范围分类：1、疾病的基本病理过程动物模型2、各系统疾病动物模型31疾病的基本病理过程动物模型是指各种疾病共同性的一些病理变化过程模型。疾病的基本病理过程：致病因素在一定条件下作用于动物，使动物组织、器官或全身造成一定病理损伤

13、，出现各种功能、代谢和形成结构的变化，其中有些变化是各种疾病都可能发生的，不是某种疾病所特有的一些变化，如发热、缺氧、水肿、炎症、休克、弥漫性血管内凝血、电解质紊乱、酸碱平衡障碍等。32各系统疾病动物模型是指与人类各系统疾病相应的人类疾病动物模型。如心血管、呼吸、消化、造血、泌尿、生殖、内分泌、神经、运动等系统疾病模型，还包括各种传染病、寄生虫病、地方病、维生素缺乏病、物理损伤性疾病、职业病和化学中毒性疾病的动物模型。33按模型种类分类：疾病模型的种类包括整体动物、离体器官和组织、细胞株等。整体动物模型是常用的疾病模型之一，也是研究人类疾病的常用手段。34按中医药体系分类 根据中医证分类，动物

14、模型可分为阴虚、阳虚动物模型、气虚动物模型、血虚动物模型、脾虚和肾虚动物模型、厥脱证动物模型等。按中药理论分类，人类疾病动物模型包括解表药动物模型，清热药、泻下药、祛风湿药、利水渗湿、温里药、止血药、止咳药、化痰药、平喘药、安神药、平肝息风药、补益药、理气药、活血化瘀药等动物模型。 354.动物模型的选择物种遗传背景品系性别年龄动物级别36动物模型的选择:物种常见的模式动物线虫果蝇斑马鱼小鼠37线虫38 线虫模型对基础和应用生物学产生了巨大的推动作用, 并直接导致了细胞凋亡现象的发现。果蝇39双翅目昆虫，生活史短，易饲养，繁殖快，染色体少，突变型多，个体小，是一种很好的遗传学实验材料。斑马鱼4

15、0斑马鱼产卵量多、繁殖迅速、胚胎通体透明, 是进行胚胎发育机理和基因组研究的好材料。小鼠41Mouse Genome ProjectKOMP&EUCOMMIMPC 小鼠是由小家鼠演变而来。它广泛分布于世界各地，经长期人工饲养选择培育，已育成1000多近交系和独立的远交群。早在17世纪就有人用小鼠做实验，现已成为使用量最大、研究最详尽的哺乳类实验动物。动物模型的选择:遗传背景近交系远交系F1杂交系42近交系近交系：经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。经连续20代以上亲代与子代交配与全同胞兄妹交配有等同效果。基因高度一致，表型相

16、近43常见近交系44C57BL/6JBALB/cJ129远交系(封闭群）以非近亲交配方式进行繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4 代以上，封闭群亦称远交群。基因组成复杂。45常见远交系ICR小鼠KM小鼠Wistar大鼠46杂交系杂交系:两个不同近交系交配后生产的第一代优点:基因型和表型一致;杂交优势;可以接受来自双亲品系的器官移植缺点:不能自我维持品系延续F1杂交系命名：B6CBF1 47非模式动物48动物模型的选择:品系近交系品系不同，表型不同4950动物模型的选择:性别不同性别的动物对同一药物的敏感程度是有差异的，对各种刺激的反应也不一致，雌性动物性周

17、期不同阶段和怀孕、授乳时的机体反应性有较大的改变。有人分析149种毒物对不同性别大小鼠的毒性，发现雌性的敏感性稍大于雄性。如实验无特殊要求应选择雌雄各半做实验，以避免因性别差异所造成的结果误差。51动物模型的选择:年龄年龄是重要的生物量，动物的解剖生理特征和反应性随年龄增加而发生明显的变化。一般幼年动物比成年动物敏感。老年动物的代谢功能低下，反应不灵敏，一般不选用。对毒物反应的年龄差异，可能与解毒酶活性有关。人类胎儿时期缺乏这些酶，对毒物敏感，新生儿8周内达到成人水平。实验动物年龄与体重一般成正相关，大小鼠可根据体重推算年龄。体重和饲养管理密切相关。52动物模型的选择:动物级别普通级Conve

18、ntional Animal(CV)不携带所规定的人畜共患病病原和动物烈性传染病的病原。清洁级Clean Animal(CL)除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。无特定病原体动物Specific Pathogen Free Animal(SPF)是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物。无菌动物Germ Free Animal(GF)无可检出的一切生命体。53病毒检测项目54动物等级病 毒小鼠无菌动物无特定病原体动物清洁动物淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV)汉坦病毒 Hantaviru

19、s (HV)鼠痘病毒 Ectromelia Virus (Ect.)小鼠肝炎病毒 Mouse Hepatitis Virus (MHV)仙台病毒 Sendai Virus (SV)小鼠肺炎病毒 Pneumonia Virus of Mice (PVM)呼肠孤病毒型 Reovirus type (Reo-3)小鼠细小病毒 Minute Virus of Mice (MVM)小鼠脑脊髓炎病毒 Theilers Mouse Encephalomyelitis Virus(TMEV)小鼠腺病毒 Mouse Adenovirus (Mad)多瘤病毒 Polyoma Virus (POLY)无任何可查到的

20、病毒 注：必须检测项目，要求阴性；必要时检查项目，要求阴性。病原菌检测项目55动物等级病 原 菌小鼠无菌动物无特定病原体动物清洁动物沙门菌 Salmonella spp单核细胞增生性李斯特杆菌 Listeria monocytogenes假结核耶尔森菌 Yersinia pseudotuberculosis小肠结肠炎耶尔森菌 Yesinia enterocolitica皮肤病原真菌 Pathogenic dermal fungi念珠状链杆菌 Streptobacillus moniliformis支气管鲍特杆菌 Bordetella bronchiseptica支原体 Mycoplasma s

21、pp鼠棒状杆菌 Corynebacterium kutscheri泰泽病原体 Tyzzers organism大肠埃希菌O115 a,C,K(B)Escherichia coli O115 a,C,K(B) 嗜肺巴斯德杆菌 Pasteurella pneumotropica肺炎克雷伯杆菌 Klebsiella pneumoniae金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus肺炎链球菌 Streptococcus pnemoniae乙型溶血性链球菌 -hemolyticstreptococcus绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa无任何可查到的细菌 注：必须检测项

22、目，要求阴性；必要时检查项目，要求阴性。寄生虫检测项目56动物等级寄 生 虫小鼠无菌动物无特定病原体动物清洁动物体外寄生虫（节肢动物）Ectoparasites弓形虫Toxoplasma gondii兔脑原虫 Encephalitozoon cuniculi卡氏肺孢子虫 Pneumocystis carinii全部蠕虫 All Helminths鞭毛虫 Flagellates纤毛虫 Ciliates无任何可查到的寄生虫 注：必须检测项目，要求阴性；必要时检查项目，要求阴性。屏障环境指标（SPF级以上）57项 目指 标温度，20-26相对湿度，4070换气次数， 次/h1020*气流速度， m/

23、s0.10.2压强梯度， Pa2050*空气洁净度， 级10000落下菌数，个/皿 3氨浓度，mg/m3 14噪声，dB 60照度，lx工作照度150300动物照度1520昼夜明暗交替时间，h12/12总结：动物模型的选择58物种近交系 or 远交系品系性别年龄动物级别实验目的PART II遗传工程动物模型59基因工程改造转基因（Transgene）基因敲除（Knockout）全敲（Conventional Knockout）条件性基因敲除（Conditional knockout）基因敲入（Knockin）CRISPR/Cas9诱导性调控（Inducible）601.转基因61过表达外源基因随机插入表达量与插入位点，插入量相关转基因原件PromoterCDSpolyAIRESeGFP，tdTomato，YFPlacZtTA/rtTA622.基因敲除63Embryonic Stem Cells(ES Cells)来源：囊胚内细胞团全能性未分化状态Germline Transmission Potential64ES Cell Lines改造后适合基因打靶的ES细胞系稳定性多能性Germline传递效率高背景，遗传信息清晰65同源重组66Holliday Junction67Convent