葡萄糖参考方法

1、测定葡萄糖的推荐参考方法样本处理、保存和储藏a：在处理任何葡萄糖溶液中最基本的预防措施是防止糖分解。这种方法设计用 于无细胞的样本。为了更好地保持葡萄糖的最初浓度必须避免微生物和细菌污 染，这是样本分解的主要来源，少量样本的蒸发也可能产生严重问题，由于化学 污染能在很短时间内产生，因此，在处理和保存样本时严格要求样本瓶清洁、无 菌、密闭。b:葡萄糖标准溶解稀释在1g/L安息香酸溶液中，可抗微生物污染，它在4P可长 期保存在室温下可稳定数周。葡萄糖标准的水稀释液或其他稀释液和复溶冻十品 对糖分解非常不稳定，须经过无菌或加入防腐剂处理。c：用于这个分析的样本所使用的生物样品严格限定为血清和血浆，两

2、种标本在 制备与保存中要求特殊的防腐抗细菌学糖酵解以及细胞学伤害。冻干血清产品不 一定分离这些污染物，通常比新鲜收集的阴性血清糖酵解速度快。血液在无菌条 件下收集，即使使用了防腐剂，过期控制与校准品样品也必须进行过滤以除掉组 织细胞和微生物，由于细胞糖酵解的完全抑制剂有限，许多这样物质存在干扰问 题，因此血浆与血清必须离心确保产生与细胞分离的血清。血清可以保存到任何 时间。在含有抗凝剂或收集的血清中加入足量防腐剂。肝素、草酸盐、柠檬酸和 EDTA不干扰这项分析。NaF是安全防腐剂，但是作为高浓度的专用抗凝剂不可 避免的产生血浆不稳定并干扰这项分析。肝素以外的抗凝剂导致血样本中细胞内 水和其他物

3、质的渗透压的改变，最终导致血浆葡萄糖浓度的改变。d.血中NaF在2.0mg/ml浓度是推荐防腐浓度。NaF最好与1mg/mlEDTA-Na2盐 联合使用，这个混合物在常规真空采血管中是可能的(加到收集的血清或血浆中， 1mg/ml NaF浓度足够)。e：收集的新鲜样本必须立即混匀，轻轻地溶解十的抗凝剂，防止冷冻血浆中Fb 的后期问题.f样本长期储藏的关键是无菌、密闭、低温和远离细胞或化学污染物。超过48h 的保存，即使已经经防腐处理，样本也应在容器中冷冻，确保密闭和防止水蒸气 渗入；选择深色小玻璃瓶。通过特定的合适的螺旋帽可获得一个很好的密封，在 小于30C的水容箱中冰冻样本迅速融化。在同一瓶

4、反复溶解，样本反复取样， 增加样本潜在分解、蒸发和污染的危险。要求和材料说明a:量值测量天平精密度天平准确度样本转移(量取)b:分光光度计测量比色杯系统固定位置单一杯子单一 1.0cm比色杯340nm分光光度计特性光谱溶液、波长和杂散光：340nm时半波宽8nm。重复测定340nm处 波长精密度和准确度在土2nm之间，340nm处杂散光0.1%，这些影响因素的总和 被消除时不降低仪器对超浓度NADH的溶液的线性反应性，NADH溶液吸光度的实 验在340nm时，吸光度在正常设定狭缝宽度时为1.010%范围内。适当的空白 溶液时在仪器半波宽2倍外时不改变超过0.5%。（b）稳定性：低于噪音，每小时

5、吸光度漂移0.001Abs，在要求的狭缝和能 量水平时，在1.0 Abs时，每小时吸光度漂移0.003 Abs。（c）分光光度计不精密度，包括噪声。对0.000-1.500 Abs范围甚至更宽 时，重复读数时的变异率（1SD）0.0005 Abs或任意吸光度读数的0.25%。（d）分光光度计线性：在0.100-1.000 Abs之间的任何水平，测定吸光度 的线性斜率是最好的，通过调零后，应0.001 Abs或小于吸光度的0.5%。在葡萄糖分析或NADH的精确稀释量的吸光度测量的定标反应曲线的测量 中，（分光光度计元件导致的）相应浓度吸光度的变化率的测量误差，与 0.2-1.000 Abs之间的

6、测定的变异率0.5%没有明显不同，0.2 Abs时，相应影 响在均值变化率+0.001 Abs c：玻璃制品（1）所有玻璃制品必须化学清洁，清洁程序包括至少用（）冲洗2遍，蒸馏 水和在清洁环境中干燥。（2）（3）d：化学说明书：（1）试剂水：（2）无CO水：试剂水在敞开的长颈烧瓶中煮沸15分钟，用透明的玻璃瓶盖 或用碱石灰帽盖住冷却，直到使用前。（3）葡萄糖标准：用国家标物局有证D-葡萄糖标准品：SRM917配制，葡萄糖 标准液的原有尖顶瓶储存于实验室的充满无水硫酸钙的真空干燥容器中。（4）化学试剂（a）硫酸锌，7个结品水，ACS说明书（b）Ba（OH） 2,8H2O, ACS 说明书（c）醋

7、酸Mg,4 H2O, ACS说明书（d）Tris base ， reagent grade（e）Tris -HCL reagent grade（f） B-NAD+（氧化型），2 H2O,纯度98%，常规称重。（g）ATP-Na2.3 H2O,纯度98%，常规称重。（h）牛血清AlB，第五部分，纯度96-99%。（i） 葡萄糖-1-磷酸，二钠盐，4 HO，纯度98%2（j）D-果糖，NAS/NRC说明书（k）安息香酸：见ACS说明书（5）酶说明：（a） HK（ATP:6-磷酸D-葡萄糖转移酶；EC 2.7.1.1）,酶来源于酵母，要求 高纯度，4.d中给出恰当的酶检验数据，注意4.d（2）.（b

8、）G6PDH（6-磷酸-D-葡萄糖：NAD（P）氧化还原酶；EC 1.1.1.49），酶来 源于肠膜明串珠菌，可以悬浮于硫酸胺液或为冻干粉，要求高纯度，4.d 中给出恰当的验证数据，注意4.d（2）.血清或血浆中葡萄糖测定程序：a:原液标准液的配制：（1）安息香酸稀释液（1g/l）：在大容量瓶中用2000ml热的试剂水溶解 2.0gACS级安息香酸，彻底混匀，盖盖冷却全室温。全部液体倒进试 剂瓶，密闭保存于室温。（2）葡萄糖标准贮存液（10g/l）：称取5.0000.002gNBS无水D-葡萄糖， 放入500ml class A级容量瓶中，用安息香酸稀释液冲洗和稀释葡 萄糖全容量瓶的2/3瓶处

9、，旋转使葡萄糖完全溶解，加安息香酸溶 液至500ml标记线下1cm处，把容量瓶放20C1C水槽中，水没全 瓶颈处，密闭，用安息香酸稀释液补足前平衡溶液30分钟。塞紧颠 倒混匀至少10次，每一次颠倒、旋转倒置容量瓶10秒。每125ml 一份，放入带有螺旋盖的硼硅酸盐的瓶中，盖紧并标记，还要注明 日期。保存在4C或-20C。一瓶用于制备1整套系列标准液。如果 处理得当，准备充分，这种标准原液可以长期稳定，但还是建议每6 个月重新配制。在一个新批号开始使用之前，从新标准原液配一个 新的mg/dl（11.10ml/l）工作标准，与旧的系列标准在一批测试各双 份比较它们的变异。（3）葡萄糖工作标准液（a

10、）配制一套纯品葡萄糖的系列工作标准液：葡萄糖标准原液和安息香酸稀 释液在20C+1C的水浴箱中平衡30分钟，按下表转移等份的葡萄糖原 液至100ml classA容量瓶中，用安息香酸稀释液稀释至接近刻度，在 水浴箱中平衡15分钟后调至刻度线。为配制标准需准备一特殊系列的 CLASS A级100ml容量瓶和5、10、20ml加样器。贮存标准（ml）用安息香酸稀释液稀释 的最终体积（ml）最终葡萄糖浓度Mg/dlmmol/L5.00100502.7810.001001005.5520.0010020011.1030.0010030016.6540.0010040022.20安息香酸稀释液中一部分是

11、用于配制试剂空白的，它用作“0”浓度标准液。 一次配制一套完整系列标准液，如果任何一个浓度减少或有怀疑，整批都将被替 换。旧的和新的系列标准通过一个分析批双份分析测试进行比较。工作标准液贮存于4-ounce聚乙烯螺旋帽瓶中，放4。不超过1个月。塑料存贮瓶的清洗很关键，交叉污染不被发现，对测定的影响会从一种 溶液倒另一种溶液。尽管安息香酸是一种很好的抗常规糖酵解微生物的 防腐剂，它不能防御严重的细菌污染。在每一分析日中，要求平衡至25r的工作标准重新分到干净管中，原液 瓶重新放回冰箱。b试剂配制沉淀蛋白试剂ZnSO4溶液(22g/l)：用刚配好的热的无CO蒸馏水大约900ml溶解22g ZnSO

12、47 H2O，溶液冷却全室温后，移到1L容量瓶中，用无CO2水稀释至1000ml充 分混匀，移至玻璃瓶，密闭保存。2饱和Ba(OH)2溶液，用刚配好的热的无CO2蒸馏水约950ml溶解刚开瓶称取的 80g Ba(OH)8H2O，溶液冷至室温，移到、L容量瓶中，用无CO2蒸馏水稀释 至1000ml，2充分混匀，转移到存储瓶中，存储瓶用短圆柱形指示型SIO2凝 胶(硅胶)保护碱石灰咀，咀的寿命相当短，碱石灰必须经常更换。允许超 量的Ba(OH)2和不溶解的碳酸盐沉淀过夜或几天，必要时，稀释前清除它。Ba(OH)溶液，0.11N。如果不干扰沉淀，转移245ml饱和Ba(OH)到1L 容量瓶；用无CO

13、蒸馏水稀释至1000ml，用这个稀释的Ba(OH)溶液滴 定10ml硫酸锌裕2液用酚酞做指示剂(0.5%指示剂溶解于95%乙醇中，2 滴)滴至淡粉色为终点，结果应为10ml ZnSO溶液需要100.1ml Ba(OH) 溶液滴定。若超过这个范围，在Ba(OH)溶液中根据大致计算量加入适 量Ba(OH)或无CO2水，重新滴定。转移校正好的Ba(OH)溶液至使用碱 石灰咀和苏打水瓶或细水瓶管试剂瓶中，每个月用滴定法检查该溶液当 量浓度。25r 时，PH7.5 的 0.1m Tris buffer,含 5.0mmol/l 乙酸镁(a) TRIS-HCL原液，在2.0L的容量瓶中用试剂水溶解31.52

14、g TRIS-HCL并 稀释到2000ml。Tris base原液：在500ml容量瓶中用试剂水溶解6.06 g Tris base并 稀释至500ml。配制酶试剂时需新鲜配制这个原液。PH7.5 Tris -Mg buffer，在一个大烧杯里，混合 800ml Tris -HCL 液和 200ml的Tris base溶液，然后在溶液里溶解1.1g醋酸镁。在25C测定 混合液的PH,必要时，用Tris-HCL液或Tris base溶液调至PH7.50.1。 用0.45 “m滤菌膜过滤溶液，到一个无菌带螺旋帽的硼硅酸盐玻璃贮存瓶 中，配酶试剂时要新鲜配制，贮存于4C冰箱。C :酶试剂的准备与分析

15、(1)酶试剂成分的本质分析(a)试剂Tris -白蛋白：在250ml容量瓶中用Tris -Mg buffer溶解0.5g牛血清 白蛋白，校正至250ml。储存在大约4C冰箱。NAD+原液：在Tris -Mg缓冲液中溶解0.9952g氧化型NAD+，补足至250ml， 在4C冰箱保存，配制当天测定。ATP原液：在Tris -Mg buffer中溶解0.8268g ATP二钠盐，并补足全 250ml，保存于4C冰箱，配制当天测定。葡萄糖，用0.1%安息香酸稀释60ml葡萄糖标准原液至100ml，保存在4C 冰箱。己糖激酶原液：在25 C称量或用Darrow和Colowick的方法或使用6-磷 酸葡

16、萄糖脱H酶的方法测定酶含量获得总活性1250U的己糖激酶，转移至250ml 酶的容量瓶，用Tris -Mg buffer调至刻度，放在4C冰箱保存，配制当天分 析。6-磷酸葡萄糖脱H酶原液：在25 C称量或用olive和Levy的方法或用己 糖激酶分析的一组相似的方法获得总活性1250U的6-磷酸葡萄糖脱H酶。用Tris -Mg buffer溶解至250ml，保存于4C冰箱，配制当天测定。注意：己糖激酶或脱H酶的活性可从厂家说明书提供的分析资料获得，这些信息 包括U/瓶(冻干或悬浮)，U/ml (悬浮)，U/mg (冻十)或U/mg蛋白和U/ml (悬 浮)，悬浮的液体最好通过称重法测定体积量

17、或直接称量1250U的酶，精确测量 1250U不是绝对必要的，但应尽可能测准。假如不能评估酶浓度，仅配制基本的 10ml酶原液并分析它。(b)己糖激酶分析(i )将上述试剂i -vi和0.1MTris - Mg缓冲液放在25C0.2C的水浴箱中，放 20分钟，使液体达到预定温度(原液放冰箱保存，除非需移液时)。己糖激酶实验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的NAD+原液， ATP原液、葡萄糖、脱氢酶原液和Tris -Mg缓冲液，10ml可满足最初的和重 复三次分析量。己糖激酶稀释液:取1ml己糖激酶原液用0.2%Tris - ALB液稀释至100ml。分析：将己糖激酶实验试剂、5ml己糖

18、激酶稀释液和含有5ml 0.2%Tris -ALB液的密闭的试管放在25C0.2t的水浴箱中大约10分钟使液体达到预定 温度。空白测定Tris-ALB (ml)1.0HK稀释液(ml)1.0HK实验试剂(ml)5.05.0混匀，立即转移到已含有温度控制在25C0.2C样本的分光光度计的2个检测 反应杯中，在340nm连续测定5分钟内空白和试验管的吸光度，对5分钟内任意 1分钟吸光度变化应基本一致，在0.005A/分以内，对这个分析而言NAD+的下降 表示分析偏差。己糖激酶原液催化活性的计算。HK 原液活性量= (dA/dt)/(EXb) XVr/Vs=dA/dt X (1/6.23 X 103

19、 l.cm/mol.cm) X Vr/Vs=dA/dt X (0.0001605mol/l) X (10ep mol/mol) X (1/ 103ml ) X (6/Vs)= Atest(3 分)*.2 分) X ( 0.963|J mol/mol )X (1/Vs)=p mol/min.ml=U/ml(25CHK 原液)dA=吸光度变化率(本次分析用3分钟和2分钟读数的变化)dt=测定时间变化E=摩尔吸光度(本次分析条件下，值为6.23X103l/mol.cm)b=光径(用厘米表示)仁用毫升表示的总的反应体积（上面给出的程序，体积为6ml： 5ml HK试验试 剂+1ml稀释HK）Vs=用m

20、l表示的总反应量中的酶原液量（上面给出的程序：1ml被稀释HK加到 反应混合液中（包含0.01ml酶原液），因此Vs是0.01ml。（vi）例如：配制一个HK原液：用厂家报告的含有1395U/ml的商业的悬浮于硫 酸铵溶液的HKlml,用Darrow和Colowick的方法在30C测定，用Tris - Mg buffer稀释至250ml。HK分析中使用1mlHK原液，3分钟时吸光度是0.203，在 2分钟时，吸光度是0.166HK U/原液的 ml 数=（0.203-0.166） /minX 0.963 mol/ml X 1/0.01=3.56U/ml（在 25C）（c）6-磷酸葡萄糖脱氢酶分

21、析（i）将（a）中 i-vi试剂和 0.1MTris -Mg buffer 放在 25C0.2C的水浴 箱中，放20分钟，使液体达到预定温度（原液放冰箱保存，除非需移液时）。（ii）6-磷酸葡萄糖脱氢酶试验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的 NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、HK原液和Tris -Mg缓冲液，10ml可满足最初 的和重复三次分析量。（iii）6-磷酸葡萄糖脱氢酶稀释液：取1ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液用0.2%Tris -ALB液稀释至100ml。（iv）分析：将6-磷酸葡萄糖脱氢酶实验试剂、5ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶稀释 液和含有5ml 0.2%Tris -ALB

22、液的密闭的试管放在25C0.2C的水浴箱中大 约10分钟使液体达到预定温度。空白测定Tris-ALB(ml)1.0G6PDH稀释液（ml）1.0G6PDH实验试剂（ml）5.05.0混匀，立即转移到已含有温度控制在25C0.2C样本的分光光度计的2个检测 反应杯中，在340nm连续测定5分钟内空白和试验管的吸光度，对5分钟内任意 1分钟吸光度变化应基本一致，在0.005A/分以内，对这个分析而言NAD+的下降 表示分析偏差。（V）6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液活性的计算 6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液活性二*知(3分)-Atest (2分) X ( 0.963仇mol/mol)X (1/Vs)test t

23、est=U/ml（25C6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液）Vs=在总反应量中，酶原液的量（用ml表示）（上面给出的程序中，被加到反应 混合液中的1ml稀释的6-磷酸葡萄糖脱氢酶包含 0.01ml酶原液，因此 Vs=0.01ml）。其他因素的解释见（b） （v）。（d）NAD+分析（i）将（a）中足量的 ii-vi 试剂和 0.1MTris -Mg buffer 放在 25C1C 的 水浴箱中，放20分钟，使液体达到预定温度（原液放冰箱保存，除非需移液时）。（n） NAD+试验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的ATP原液、葡萄 糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液和Tris -Mg缓冲液，10

24、ml足够。（iii）稀释NAD+：取5ml NAD+原液，用Tris -Mg缓冲液稀释到100ml。（iv）分析：将NAD+实验试剂、5ml稀释NAD+和含有5ml Tris -Mg缓冲液的密 闭的试管放在25C1C的水浴箱中大约10分钟使液体达到预定温度。空白测定Tris-Mg 缓冲液(ml)1.0NAD+稀释液（ml）1.0NAD+实验试剂（ml）5.05.0混匀，立即转移到已含有温度控制在25C1C样本的分光光度计的2个检测反 应杯中，加入NAD+实验试剂10分钟后，在340nm测定空白和试验管的吸光度。 反应在10分钟内达到平衡。（v）NAD+原液中NAD+浓度的计算：C=A/ (EX

25、b)XVr/Vs=A (10 分)/ (6.23 X 103 l.cm/mol.cm) X (6ml/0.05ml)=* t(10 分)X0.01926mmol/ml=mmol/ ml(NAD+原液)C=浓度( mmol/ml)A=吸光度E=摩尔吸光系数(对于本试验：值是6.23X 103l/mol.cm)b=用cm表示的光径Vr=用ml表示的总反应体积Vs=在总反应体积中NAD+原液体积(用ml表示)本试验中NAD+原液浓度至少应在0.005mmol/ml之上，否则该来源NAD+不 能用于测定葡萄糖。ATP 分析：将(a)中足量的 ii-vi 试剂和 0.1MTris -Mg buffer

26、放在 25C1C 的 水浴箱中，放20分钟，使液体达到预定温度(原液放冰箱保存，除非需移液时)。(n) ATP试验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的NAD+原液、葡萄 糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液和Tris -Mg缓冲液，10ml足够。稀释ATP：取5mlATP原液，用Tris - Mg缓冲液稀释到100ml。分析：将ATP实验试剂、5ml稀释ATP和含有5ml Tris - Mg缓冲液的密 闭的试管放在25C1C的水浴箱中大约10分钟使液体达到预定温度。空白测定Tris-Mg 缓冲液(ml)1.0ATP稀释液(ml)1.0ATP实验试剂(ml)5.05.0混匀，立即转移到已

27、含有温度控制在25C1C样本的分光光度计的2个检测反 应杯中，加入ATP实验试剂10分钟后，在340nm测定空白和试验管的吸光度。 反应在10分钟内达到平衡。ATP原液中ATP浓度的计算C= * t(10 分)X0.01926mmol/ml=mmol/ml(ATP 原液)各因素来源解释见(d) (v)如果ATP原液浓度0.005mmol/l，则该ATP来源不适用于葡萄糖测定。酶试剂准备(a)如果ATP、NAD+、HK和6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液按上述方法检测合格， 酶试剂按下列方法配制：(i)在1L容量瓶中加200mlATP原液。()加 200ml NAD+原液()加入相当于总活性800U的6-

28、磷酸葡萄糖脱氢酶原液，例如：6-磷酸葡萄 糖脱氢酶原液4U/ml，则需在这个容量瓶中加入200ml，如果原液2.7 U/ml， 则应加入300ml。对于配制200ml的酶原始储存溶液而言，加入纯酶量相当于起 始试剂量的4/5体积合适，这个新要求的原液量是计算起始量的一半。加入相等于总活性800U的HK原液到1L容量瓶中，例如：原液活性4U/ml， 则需在这个容量瓶中加入 200ml，如果酶原液含量2.7U/ml，则应加入酶 量300ml，应配制更高浓度的酶原液。对于200ml的起始的酶溶液而言，加入纯 酶量相当于起始试剂的4/5体积合适。用Tris - Mg缓冲液稀释到1L，轻轻颠倒混匀，不要

29、用力振荡。酶试剂配好后，立即取100ml (100ml相当19个实验)放入清洁、干燥、 带螺旋帽的125ml深棕色的硼硅酸盐玻璃瓶中，使用前保存于-20C。配制和保 存的酶试剂在这种条件下可稳定大约6个月，分析当天，从冰箱取出酶试剂放 25C水浴大约1小时或平衡至25C1C。d酶试剂验证试验(1)酶试剂稳定性：取100mg/dl(5mmol/L的葡萄糖标准6ml，稀释成相当于 600mg/dl(33mmol/L)标准的上清液，与15ml试剂水混合，用1ml这个稀释液混 合5ml酶试剂，立即转移到分光光度计的比色杯中，第二个比色杯不放试剂水(以 试剂水为空白)，在340nm纪录30分钟溶液吸光度

30、变化。如果酶试剂与葡萄糖稀 释液混合后的溶液在6分钟吸光度读数在1.6-1.8A，在8和30分钟时吸光度值 0.010A，表明酶试剂质量没有问题。酶污染检验：加100mg果糖和50mgG-1-P到50ml容量瓶中，用安息香酸稀释到50ml，充分混 匀，这是碳水化合物溶液。在一个锥形瓶上标明“碳水化合物-葡萄糖”，加1ml 碳水化合物溶液和1ml200mg/dl(11.10mmol/L)葡萄糖标准，混合后加40ml试剂 水，再混匀，在标有“空白”和“试验”的2个试管中各加入5山1酶试剂，空白 管加1.0ml安息香酸稀释液，试验管加1.0ml碳水化合物-葡萄糖溶液，充分混 匀各管，不要剧烈震荡，立

31、即转移到经过光径标准的分光光度计的反应杯中，在 340nm波长以试剂水为空白测定并记录各管吸光度。以碳水化合物溶液加入酶试 剂的杯为零点。如果(a)试验管在6和30分钟时吸光度的差值0.010A(b)空 白管在6和30分钟时吸光度的差值0.005A(c)30分钟吸光度的差值 0.08A(d)30分钟时试验吸光度的茶汁再用相同方法或规定试验程序检测是 100mg/dl葡萄糖标准吸光度-0标准吸光度的差值的4%以内时，酶试剂证明是有 效的，如果一台分光光度计检测和记录一种溶液一试剂水的性能是可以接受的， 首先进行试验杯的测定，紧接着测定“空白杯”，假如一台分光光度计检测和记 录三种溶液一试剂水的性能是可接受的，实验(1)和(2)可以同时进行，假如 有多个反应杯，监视和测定同时进行，在进行大量试验前先确定吸光度在 0.100 + 0.01A时，平均被校正地读数不超过这批平均吸